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分光光度计的结构与使用方法 2008-12-31 10:02:01??作者：??来源：互联网??浏览次数：122??文字大小：【大】【中】【小】 ?1.?分光光度法定义与应用 1.1?定义:?分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术. 1.2?特点:?灵敏,精确,快速和简便,在复杂组分系统中,不需要分离,即能检测出其中所含的极少量物质. 1.3?应用:?生物化学研究中广泛使用的方法之一,广泛用于糖,蛋白质,核酸,酶等的快速定量检测.? 2.?分光光度计的基本结构和工作原理 2.1?分光光度计的分类 2.2?分光光度计工作原理 2.3?分光光度计的基本结构 2.4?分光光度法的测量误差 2.5?显色反应及其影响因素 2.1?分光光度计的分类 分光光度计的分类 红外分光光度计:?测定波长范围为大于760?nm的红外光区 可见光分光光度计:?测定波长范围为400~760?nm的可见光区 紫外分光光度计:?测定波长范围为200～400?nm的紫外光区 2.2?分光光度计工作原理 人眼可见的光只占电磁波谱的很小—部分(400~760nm)它是一种频率较大的电磁波.电磁波按频率大小,从频率最小的无线电波到频率最大的γ-射线排成一列,即组成电磁波的波谱,2.2.1?分光光度计的光谱范围 包括波长范围为400~760?nm的可见光区和波长范围为200～400?nm的紫外光区.不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源. 钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400～760nm波长的光谱,光通过三棱镜折射后,可得到由红,橙,黄,绿,蓝,靛,紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源. 氢灯的发射光谱:氢灯能发出185～400?nm波长的光谱,可作为紫外光光度计的光源. 2.2.2?物质的吸收光谱(1)? 如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱,它出现了几条暗线,即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失,这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱. 不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质.? 2.2.2?物质的吸收光谱(2) 当光线通过某种物质的溶液时,透过的光的强度减弱.因为有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被组成此溶液的物质所吸收,只有一部分光可透过溶液. 入射光?=?反射光?+?分散光?+?吸收光?+?透过光 如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为空白去校正反射,分散等因素造成的入射光的损失,则: 入射光?=?吸收光?十?透过光? 2.2.3?物质吸光度(A)与透射比(T)的关系 设?I0?为经过空白校正后入射光的强度;I?为透过光的强度. 根据实验得知?I?=?I0??10-εc?l 式中,c?表示吸收物质的摩尔浓度;l?表示吸收物质的光径,用cm表示;ε表示吸收物质的摩尔消光系数,它表示物质对光的吸收特性,不同物质的ε数值不同.?所以?I?/?I0?=?10-εc?l? 令?T(透射比)?=?I?/?I?0?T?=?10-εcl? 若以T对吸收物质的浓度作图,则得图1-5-2中的曲线. 由上式可得?1g(1?/?T)?=?εc?l? lg(l?/?T)为物质的吸光度(A)?A?=?1g(1?/?T)? 2.2.4?Lambert?-Beer定律(?E?=?εc?l) 上式说明了物质的吸光度与吸收物质的浓度和液层的厚度成正比,这就是光吸收的基本定律--Lambert-Beer(朗伯-比耳)定律. 2.3?分光光度计的基本结构 无论哪一类分光光度计都包括?:光源,单色器,吸收池,检测器和测量仪表.分光光度计各部件的次序如图所示:? 5个基本部件 分光光度计的基本部件(1): 光?源:?分光光度计上常用的光源有两种:钨丝灯或氢灯,在可见光区,近紫外光区和近红外光区常用钨丝灯作为光源;在紫外光区多使用氢弧灯. 单色器:把混合光波分解为单—波长光的装置.在分光光度计中多用?作为色散元件. 吸收池比色杯,比色皿,比色池)一般由玻璃,石英或熔凝石英制成,用来盛被测的溶液.在低于350?nm的紫外光区工作时,必须采用石英池或熔凝石英池.?? 分光光度计的基本部件(2): 吸收池(比色皿)必须与光束方向垂直.此外,每套比色皿的质料,厚度应完全相同,以免产生误差.比色皿上的指纹,油污或壁上的沉积物都会显著地影响其透光性,因此在使用前务必彻底清洗. 常用光电池,光电管和光电倍增管三种.? 测量装置?—般常用的紫外光和可见光分光光度计有3种测量装置,即电流表,记录器和数字示值读数单元.现代的仪器常附有自动记录