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免疫印迹 Western Blotting SDS PAGE 郝林琳 动物生物技术系 吉林大学畜牧兽医学院 * 一、原理： 电泳(Electrophoresis)是指带电荷的物质在电场中向与自身所带电荷相反方向移动的现象 。 生物大分子如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，在某一特定pH值下可以带正电或负电，在电场中向正极或负极迁移。 利用人工合成的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物(形成电场）对蛋白质进行电泳。 调整丙烯酰胺（ACR）和甲叉双丙烯酰胺（BIS）的浓度可以得到不同孔径的聚丙烯酰胺凝胶，以用来分离不同大小分子量的蛋白质。  任何蛋白质粒子在环境pH大于其等电点时均带有负电荷，在电场中向着正极泳动。 * 各种蛋白分子在聚丙烯酰胺凝胶内泳动的速度取决于其所带电荷多少以及分子量的大小。  带电荷多的泳动的速度就快，反之就慢。分子量小的泳动的速度就快，而分子量大的泳动速度就慢。 蛋白分子的形状也会影响蛋白质在凝胶中的泳动速度，如：球形蛋白就比纤维蛋白的泳动速度快。 电压和电流强度的大小对于所有蛋白质都有直接作用，即强度大，泳动速度快，反之则慢。 缓冲液的离子强度与蛋白质的泳动速度呈正相关。 * (一)样品凝胶电泳 * SDS polyacrylamide-gel electrophoresis * Analysis of protein samples by SDS polyacrylamide gel electrophoresis SDS* 操作步骤 lSDS灌胶 12%分离胶： H2O 2.45ml 30%丙稀酰胺 3ml 1.5M Tris-cl 1.9ml 10%SDS 75ul 10%过硫酸胺 75ul TEMED 8ul 7.5ml * 操作步骤 lSDS灌胶 5%浓缩胶 H2O 3.4ml 30%丙稀酰胺 830ul 1 M Tris-cl 630ul 10%SDS 50ul 10%过硫酸胺 50ul TEMED 8ul 5ml * 将小烧杯内的各组分轻轻混匀，用较大容量的移液器（或直接倾倒）将其加到两玻璃板夹缝内，然后，用移液器在凝胶上面缓慢加入2ml蒸馏水。 待凝胶完全凝固后（约15~20分钟），倾去上层水，再以相同的方法配制浓缩胶并加于分离胶之上，将样品梳子插入两玻璃板浓缩胶上。待凝胶完全凝固（约15~20钟），拔出梳子。2、加样： 用微量注射器吸取样品20ul加于玻璃板凝胶槽内，待全部样品加完后，向电泳槽（架）内、外加适量的电极缓冲液。 * 3、通电： 连接好正、负极电源，通电并调电压120 V，待样品进入分离胶再调电压230 V。 4、 结束电泳 当样品泳动到距凝胶板下沿1cm处时，关闭电源。  5、染色：  取下凝胶板，从两玻璃板之间取出凝 胶，置于盛有染色液的培养皿中（注意：不要将凝胶弄断）染色2小时。  6、脱色： 将培养皿中染色液换成脱色液，继续脱色8-12小时即可观察蛋白区带。 * 操作步骤 lSDS待胶凝固后开始点样(上样量5ul)，70V积层胶；170V分离胶 * * 免疫印迹 Western Blotting *