第4章酶的分离纯化剖析.ppt

第四章 酶的分离与纯化 酶的分离纯化策略 酶液的制备与初分离 酶的分离纯化方法 酶纯度的检验 酶的提取和分离纯化是指把酶从组织中、细胞内或细胞外液中提取出来并使之达到与使用目的相适应的纯度。 酶的分离提纯包括三个基本环节： 一是抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液； 二是纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来； 三是制剂，即将酶制成各种剂型。 空间结构的稳定性 有活性的酶的空间稳定性有限，不同的酶可能有不同的稳定性 保持稳定性的环境因素 离子强度适当 最适pH 低温 加入稳定性：甘油、糖类、聚乙二醇等 第一节 酶的分离纯化策略 一、酶分离纯化基本原则 防止变性失活 低温进行 防止局部的过酸过碱 避免剧烈搅拌和泡沫形成 重金属离子能引起酶失活，有机溶剂会使酶失活，微生物污染以及蛋白酶的存在会使酶分解破坏， 其他因素：水质、辅因子等 二、酶的分离纯化策略 1、目的明确 用途： 医疗用途、活体研究等 极高纯度＞99% X射线结晶、物理化学性质研究等 高纯度95-99% N端测序、生产抗原等 一般纯度＜95% 2、建立一个可靠、快速的分析方法 目标酶蛋白，蛋白质纯度的检测，总蛋白量的检测，对必须清除的杂质的分析 纯化方法的选择--解决纯化倍数和回收率的矛盾 建立以下分析通道： 快速、可靠的分析目标酶蛋白的方法（酶活力测定方法） 蛋白质纯度检测方法 总蛋白的检测方法 对必须清除的杂质分析方法 此外，还需尽量做到 纯化过程中不宜重复相同的步骤和条件 减少添加剂的使用 尽早去除有破坏型的杂质 尽早采用高效分离方法，将最昂贵、最费时的分离方法防在最后阶段。 3、纯化方法的选择 评定好坏的标准： 比活力提高倍数 总活力的回收率 重现性 表4-3 常用的提纯方法 比活力提高倍数是纯化后样品的酶比活力与纯化前比活力的比值，较大的倍数表示比活力明显提高，说明操作的有效性。 总活力的回收率是指纯化后样品的总活力占前样品总酶活的百分比。这一比值越高说明该操作步骤对酶活的保存率越高。 较好的重现性是所有方法可行性的必要条件。 酶的分离纯化一般程序可以分为 预处理：包括材料的选择、发酵液的预处理和细胞的破碎等。 粗分级分离：等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀、萃取和离心分离。 细分级分离：通常用色谱分离 成品制作：透析、超滤、结晶和冷冻干燥等。 第二节 酶液的制备和初分离 一、材料的预处理 动物材料： 除去与实验无关甚至有妨碍的结缔组 织，脂肪组织和血污等。 植物种子需要除壳 微生物材料需将菌体和发酵液成分分开 细胞壁的主要组分： 细菌：肽聚糖、N-乙酰葡糖胺、 N-乙酰胞壁酸 真菌和酵母：葡聚糖、甘露聚糖 藻类：纤丝状糖类 动物细胞无细胞壁，易破碎。 细胞破碎的方法 机械法 物理法：渗透压突变、超声波、冻融、冷冻干燥再抽提 化学法：有机溶剂处理、表面活性剂处理 生物法（酶法）：糖苷酶、溶菌酶葡聚糖酶、纤维素酶、甘露聚糖酶等 表4-4 常见的破碎细胞方法 胞内酶？细胞破碎取酶 （1）机械破碎法 液体剪切：搅拌、匀浆 固体剪切：研磨、珠磨、捣碎 （2）化学渗透：将细胞壁溶解作用和渗透压作用相结合，使细胞膜破裂而释放出胞内物质。 有机溶剂处理：溶解膜脂、干燥、抽提。 表面活性剂处理：改变膜的通透性，使之溶解，再抽提蛋白。SDS、Triton （3）酶溶解：利用溶解细胞壁的酶处理菌体，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击而破坏细胞膜。 （4）冻结-溶冻法 将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，反复操作多次达到破坏细胞壁和细胞膜的作用，适用于较脆弱的菌体。 三、抽提 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程，也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 抽提缓冲液可能组成成分 pH调节剂 离子强度调节剂：盐类 构象稳定性：甘油 抗氧剂：DTT、巯基乙醇等 重金属络合剂：EDTA、柠檬酸 蛋白酶抑制剂：PMSF、DFP等 增溶剂：Triton X-100等 影响酶提取的主要因素 （1）pH （2）温度 （3）抽提液的用量 离心 离心转数：每分钟转数（rpm） 离心分离强度：g值 换算：g=（rpm×2π/60)2/9.8 r:粒子距离轴中心的距离 低速：≦4000rpm 高速：4000-20000 rpm 超速: ＞20000 rpm 实验