病理切片笔记.doc

病理检验技术讲稿 一、组织切片常用仪器与制片技术 1、切片机及使用 切片机提供石蜡切片（或炭蜡切片）用，是切片中最常用的一种。超薄切片机的构造与使用原理基本也属于这一类型。（图4-1-1） 摇动轮的手柄转动重轮时，传动机内一组齿轮及螺纹中轴，使中轴前端的组织块固定架即按所调节的切片厚度（μm）向前推进，并上下运动，让组织块经过前下方 的轮时，传动机内一组齿轮及螺纹中，使中轴前端的组织块固定架即按所在切片操作 轴前先打开卡锁，否则重轮不能转动。 然后，将组 织块固定于固定架，最后再装切片刀。 组织块及 切片刀先后装牢固后才可掀开卡锁。 慢慢转动重 轮使装有组织块的中轴稍下降到接近刀刃处， 调 整刀的前、后进度，使刀刃即将接触组织块。 调 整刀的进度时，不让刀刃接触组织块， 以免第一 次切到时崩落组织块。此时将组织进度调节器，调 节到20μm，开始切片，待组织块切到所需的组织 图4-1-1 旋转式切片机–1 PCR仪 各100mg合并，加上离子水2ml溶解，用0.1mol/LnaOH 调至pH7.0~7.5（使其浓度为5mmol/L）分装后-20℃保存 备用。 5)、PCR反应缓冲液 有些公司将反应缓冲液随Taq酶供应给用户（通常为10 x浓度），如需自己配制，其10 x浓度组分如下： 250~500mmol/L KCl 100~500mmmol/L Tris-Cl（PH8.4） 15~20 mmol/L MgCl2 0.5% Tween-20 1mg/L BSA 6)、矿物油 7)、琼脂糖 8)、溴化乙啶(EB 10mg/ml) 3、方法 ●操作步骤 向0.5ml无菌Eppendorf管内依次加入： 1)、10x 扩增缓冲液 1/10体积。 2)、4 x dNTP各200 mmol/L 3)、引物1 1mmol/L 4)、引物2 1mmol/L 5)、DNA模板 102~105拷贝 6)、ddH2O 补足终体积（终体积为25~100ul） 7)、混合后，离心10s，使反应成分集中于管底，95变性10min，Taq酶2.0~2.5u/100ul，离心混匀。 8)、矿物油 100ul。 ●变性90~96℃ 30~60s ●退火25~65℃ 60~90s ●延伸70~74℃ 30~60s ●重复（2）~（4）25~35次，每次即为一个PCR循环，最后一个循环72℃增加5min，迅速冷却。 ●琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物。 4、注意事项 理想的PCR反应应该是特异、高效和忠实的。高度特异的PCR反应只能产生一个扩增产物；而扩增反应越有效，经过相当少的循环会产生更多的产物。为了得到理想的PCR扩增效果，必须注意以下几个方面： ●模板 PCR反应的模伴可以是DNA，也可以是RNA，后者的扩增需首先逆转录成cDNA后才能进行正常PCR循环。 不同来源的核酸标本，如临床标本（血液、痰液、尿液、粪便、体液）、法医学标本（血斑、毛发、精斑等）、病理标本（如组织学）以及考古标本等，可以用不同的方法提出DNA。不论标本来源如何，扩增均需要部分纯化，操作过程中应避免DNA的降解，并尽量使核酸标本中不含蛋白酶、核酸酶、特别是TaqDNA聚合酶抑制剂。 ●PCR反应引物设计 引物设计在PCR中占有重要的地位，可以说是成败的关键。常用引物是人工合成的寡聚核苷酸片段，耗资较大，所以要注意设计。总的原则是提高扩增的效率和特异性，具体是： 引物应位于待分析基因组中的高度保守区，应对某一基因特异，长度以15~30bp为宜。过短会使特异性降低，基因过长则成本增加，也会降低特异性，使扩增片段的长度在1kb以下，以150~600bp最好。 引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，避免连续出现4个以上的同一碱基(G十C宜在45％~55％)。 引物内部不应形成二级结构，特别是尽可能地避免引物3’-端出现二级结构。 引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性，要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索 。 引物3’~末端与模板DNA一定要配对，因为延伸是从3’末端开始，向5’~3’方向前进，不配对则会发生碱基错配位。引物5’端可以有不配对碱基，也可以在5’-端引入人为的酶切位点。 引物使用浓度一般在0.2~1μmol/L，在100μl中加入20 pmol。浓度过高会因起错配及非特异产物扩增；太低则可达不到扩增效果或产量过低。 ●DNA聚合酶（Taq DNA Polymerase） TaqDNA聚合酶70~75℃时具有最高的生物学活性。其最适pH 8.3~9.0，耐热。整个过程只需加一次。专一性较好。反应体系中Taq酶的终浓度为2~2.5u/100ul。酶量过低合成产物低，过高则有非特异产物随之增加。