研8免疫印迹技术2.pptVIP

免疫印迹技术 Western Blot 1 PVDF膜和滤纸的预处理：剪裁适当大小的PVDF膜，将其浸入甲醇液中浸泡10s（快速激活PVDF膜），去离子水处理5min，1×转移缓冲液浸泡10min以上。 四、封闭 1.目的：为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。 五、一抗、二抗杂交 把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 回收二抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。 六、检 测 根据标记Ab2的标记物不同,其杂交的结果检测方法也不同,较常用的检测系统有HRP标记Ab2的增强化学发光 ECL 和DAB检测系统. * * 凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳的方式转印至固相支持物上 三、转膜 1.转印膜比较 2.原理：将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成“Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋白质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极（如图）。 这种方法是用有孔的塑料和滤纸将凝胶和PVDF膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质在电场力的作用下离开凝胶结合到PVDF膜上。 3.操作 2 剪裁比膜略小的6层滤纸，用转移缓冲液浸泡后待用。 4 转膜 负极→纤维帕→三层滤纸→样品胶→PVDF膜→三层滤纸→纤维帕→正极 5 正确连接转移电泳连线，使电荷由负极向正极流动。接通电源，恒流转膜2h，2mA/cm2膜。此操作宜在4℃冰箱中进行。 3 取下电泳板，将其平置，去掉上层玻璃板，切除多余凝胶。 6 转膜完毕后小心取出转移膜，在1×TBST液中漂洗两次; 7 将凝胶浸入考马斯亮蓝染液中，检查蛋白转移是否完全。（此步骤可省略） 8 转膜后检测：丽春红染膜（可省略） 2.封闭的原理：用非抗原的蛋白去封闭膜，避免抗体固定在非特异性膜上而引起高背景。 3.可用的封闭剂： （1）5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h） （2）Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司） （3）Tween-20：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。 （1） 辣根过氧化物酶-DAB法:①DAB显色液的配制:按照1mlH2O加显色剂A,B,C各1滴,混匀.②显色:将适量DAB显色液平铺在Ab2杂交后（洗毕）的印迹膜上,室温放置观察,可出现明显的棕褐色蛋白显色带③终止:用Tris-HCl缓冲液或水漂洗杂交膜即可终止反应.