生化,分子,细胞试验概览.docVIP

主要培养基的配制 LB液体培养基 胰蛋白胨 10 g，酵母浸出物 5 g，氯化钠 10 g，蒸馏水 1000 ml，用 1 mol/L HCl 调节 pH 至 7.4，121℃高压灭菌 20 min。如果需要加抗生素，则待灭过菌的培养基温度降到 55℃以下后加入适量的抗生素储存液。 LB 固体培养基 在LB液体培养基中加入2%琼脂。 DMEM细胞培养基 DMEM溶液90%(v/v)，FBS 10%(v/v)，青霉素100U/ml，链霉素100 (g/ml McCoy’s 5A细胞培养基 McCoy’s 5A溶液90%(v/v)，FBS 10%(v/v),青霉素100 U/ml，链霉素100 (g/ml 实验试剂及药品的配制 1 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 在800 ml的双蒸水中溶解Tris(三羟甲基氨基甲烷)121.1 g，用浓盐酸调pH至8.0，用双蒸水定容至1000 ml。121℃高压灭菌15 min，备用。 TE 缓冲液(pH8.0) 1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)10 ml和500 mmol/L EDTA(pH8.0)溶液2 ml，用双蒸水定容至1000 ml。121℃高压灭菌15 min，备用。 500 mmol/L 乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0) 在 800 mL 的双蒸水中加入18.6 g 乙二铵四乙酸二钠，充分溶解后，用10 mol/L NaOH 溶液调pH 至8.0，用双蒸水定容到1000 ml。121℃高压灭菌 15 min，备用。 溴化乙锭(EB) 1 g EB，加入100 ml 灭菌双蒸水中，磁力搅拌数h以确保其完全溶解，然后转入棕色瓶中，4℃保存。 TAE 电泳缓冲液(50×) 242 g Tris碱，57 ml冰乙酸，100 ml 0.5M EDTA，加灭菌去离子水定容至 1000 ml，使用时稀释50倍。 10% SDS 将10 g高纯度的SDS置于烧杯中，加入约 80 ml的ddH2O，68℃加热溶解，滴加盐酸调节pH值至7.2，定容至100 ml后，室温保存。 G418 (Neomycin) 用PBS (pH 7.4) 配成浓度为50 mg/ml的原液，0.22 (m滤膜过滤除菌，分装储于-20℃备用。 基因组DNA提取液 1 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)1 mL和0.1 mol/L EDTA (pH8.0)溶液20 ml， 0.5% (m/v) SDS，加灭菌去离子水定容至100 ml，备用。 蛋白提取液 1M Tris-HCl (pH7.6) 5 ml，5 M NaCl 3 ml，10%SDS 1 ml，100% NP-40 1 ml，加灭菌去离子水定容至100 ml，备用。 100 mM 姜黄素 用DMSO配成浓度为100 mM的储存液，分装避光储存于-20℃备用。 100 mM CPT-11 CPT-11原装瓶为50 mg，加入802 (l DMSO溶解，分装储存于-20℃备用。 100 mM DHA DHA原装瓶为50 mg，加入1758 (l DMSO溶解，配成浓度为100mM的储存液，分装避光储存于-20℃备用。 100 mM 5-Fu 用DMSO配成浓度为100 mM的储存液，分装避光储存于-20℃备用。 实验方法 总RNA提取 弃12或6孔板中的原Medium后，PBS 500 ul/孔洗两次. TRIzol 1 ml/孔（组织经匀浆处理后每100 mg加入1ml的Trizol）。吹打混匀后转移到相应的做好标签的好的1.5 ml的离心管中，并立即放在冰上以防RNA降解，5 min. 氯仿 200 ul/管，剧烈震荡15 s （Don’t Vortex！），使细胞充分裂解,室温静止3 min. 4℃，12000 rcf，15 min. 转移500 ul上清到相应的做好标记的1.5 ml的离心管中，加入500 ul/管异丙醇，颠倒混匀，室温静止10 min。4℃，12000 rcf，15 min. 弃上清，加入用DEPC水配好的75%的乙醇1 ml/管，颠倒两次后，放4℃离心机，7500 rcf，5 min. 弃上清，等RNA干燥透明后加入30 ul的DEPC水，吹打混匀使得RNA溶解后，1% 凝胶电泳分析（100V 15-20 min），置于-80℃冰箱保存。 基因克隆 查找目标基因的基本信息，查找相关文献，设计克隆基因方案。利用DNA处理软件和引物设计软件设计引物，将引物序列送公司合成，根据合成引物的退火温度确定PCR退火温度。 查询该基因有表达的细胞株，培养细胞，采用Trizol法提取总RNA。 反转录。 PCR：首