口蹄疫防治技术规范附件要点.docVIP

附件一： 间接夹心酶联免疫吸附试验（I-ELISA） ? 1?试验程序和原理 1.1利用包被于固相（I，96孔平底ELISA专用微量板）的FMDV型特异性抗体（AB，包被抗体，又称为捕获抗体），捕获待检样品中相应型的FMDV抗原（Ag）。再加入与捕获抗体同一血清型，但用另一种动物制备的抗血清（Ab，检测抗体）。如果有相应型的病毒抗原存在，则形成“夹心”式结合，并被随后加入的酶结合物/显色系统（*E/S）检出。 1.2由于FMDV的多型性，和可能并发临床上难以区分的水泡性疾病，在检测病料时必然包括几个血清型（如O、A、亚洲-1型）；及临床症状相同的某些疾病，如猪水泡病（SVD）。 2?材料 2.1?样品的采集和处理 ????见附件四 2.2?主要试剂 2.2.1?抗体 2.2.1.1包被抗体：兔抗FMDV-“O”、“A”、“亚洲-I”型146S血清；及兔抗SVDV-160S血清。 2.2.1.2检测抗体：豚鼠抗FMDV-“O”、“A”、“亚洲-I”型146S血清；及豚鼠抗SVDV-160S血清。 2.2.2?酶结合物 ????兔抗豚鼠Ig抗体(Ig)-辣根过氧化物酶(HRP)结合物。 2.2.3?对照抗原 ????灭活的FMDV-“O”“A”“亚洲-I”各型及SVDV细胞病毒液。 2.2.4?底物溶液（底物/显色剂） ????3％过氧化氢/3.3mmol/L邻苯二胺(OPD)。 2.2.5?终止液 ????1.25mol/L?硫酸。 2.2.6?缓冲液 2.2.6.1包被缓冲液??0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3，pH9.6。 2.2.6.2稀释液A??0.01mol/L PBS - 0.05％(v/v)Tween-20，pH7.2～7.4。 2.2.6.3稀释液B??5％脱脂奶粉（w/v）-?稀释液A?。 2.2.6.4洗涤缓冲液??0.002mol/L PBS - 0.01％(v/v)Tween-20。 2.3?主要器材设备 2.3.1?固相 ????96孔平底聚苯乙烯ELISA专用板。 2.3.2?移液器、尖头及贮液槽 ????微量可调移液器一套，可调范围0.5～5000μL(5～6支)；多（4、8、12）孔道微量可调移液器（25～250μL）；微量可调连续加样移液器（10～100μL）；与各移液器匹配的各种尖头，及配套使用的贮液槽。 2.3.3?振荡器 ????与96孔微量板配套的旋转振荡器。 2.3.4?酶标仪,492nm波长滤光片。 2.3.5?洗板机或洗涤瓶,吸水纸巾。 2.3.6 37℃恒温温室或温箱。 3?操作方法 3.1?预备试验 ???为了确保检测结果准确可靠，必须最优化组合该ELISA，即试验所涉及的各种试剂，包括包被抗体、检测抗体、酶结合物、阳性对照抗原都要预先测定，计算出它们的最适稀释度，既保证试验结果在设定的最佳数据范围内，又不浪费试剂。使用诊断试剂盒时，可按说明书指定用量和用法。如试验结果不理想，重新滴定各种试剂后再检测。 3.2?包被固相 3.2.1?FMDV各血清型及SVDV兔抗血清分别以包被缓冲液稀释至工作浓度，然后按图3-1Ⅰ所示布局加入微量板各行。每孔50μL。加盖后37℃振荡2h。或室温（20～25℃）振荡30min，然后置湿盒中4℃过夜（可以保存1周左右）。 3.2.2?一般情况下,牛病料鉴定“O”和“A”两个型，某些地区的病料要加上“亚洲-I”型；猪病料要加上SVDV。 ??????图3-1：定型ELISA微量板包被血清布局Ⅰ?、对照和被检样品布局Ⅱ Ⅰ????????????Ⅱ1???2??????3????4?????5???6??牋??牋8牋牋9牋10牋牋11牋12 A牋燜MDV揙? C++ C++ C+牋C++ C- C- S1牋1- S3牋3- S5牋5- B牋牋牋牋揂?疫吸附试验 C++ C++ C+牋C++ C- C- S1牋1- S3牋3- S5牋5- C牋揂sia-I?附试 C++ C++ C+牋C++ C- C- S1牋1- S3牋3- S5牋5- D牋燬VDV+I C++ C++ C+牋C++ C- C- S1牋1- S3牋3- S5牋5- E牋燜MDV揙??附试 C++ C++ C+牋C++ C- C- S2牋2- S4牋4- S6牋6- F牋牋牋爴A???附试 C++ C++ C+牋C++ C- C- S2牋2- S4牋4- S6牋6- G牋揂sia-I?附试 C++ C++ C+牋C++ C- C- S2牋2- S4牋4- S6牋6- H牋燬VDV+I C++ C++ C+牋C++ C- C- S2牋2- S4牋4- S6牋6- ? 试验开始，依据当天检测样品的数量包被，或取出包被好的板子；如用可拆