实时荧光定量PCR技术的原理及应用讲稿.pptVIP

实时荧光定量PCR技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR ) 何谓PCR 简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内?(In?Vitro)?的大量合成。 基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.  PCR的要素 要被复制的DNA模板? 界定复制范围两端的引物? DNA聚合酶 合成的原料及水。 PCR的反应的三个主要步骤 变性，将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板.? 复性 是令引物于一定的温度下附着于模板DNA两端。? 延伸 在DNA聚合酶的作用下进行引物的延长及另一股的合成。 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量技术的应用 实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 实时荧光定量PCR 原理----------实时原理 常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化。 通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 实时荧光定量PCR原理----------定量原理 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析 介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线 实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值 Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan Real time PCR 方法１－－－SYBR Green l法 SYBR Green l是一种能够结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。 Real time PCR 方法2－－－ Taq Man Probe法 每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光 两种荧光检测方法的比较 实时荧光定量PCR 原理-------标准曲线 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA 相对定量中的内标 内标通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因. 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小. 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量. 用于生成标准曲线的样品如何设定？ 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 含有和待测样品相同扩增片段的cDNA 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度 根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释 实时荧光定量PCR 原理-------标准曲线 将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real time PCR，就会按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少 Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 绝对定量和相对定量解析方法 二者区别 绝对定量,是对未知样品的绝对量(拷贝数)进行测定的方法; 应用于病毒病原菌定量检测,转基因拷贝数分析等 相对定量,并不是测定基因的绝对量,而是分别测定目的基因和参比基因的量,再求出对于参比基因的目的基因的相对量,最后再进行样品间相对量的比较 应用于mRNA表达量解析. 绝对定量 绝对定量的方法相对简单. 未知浓度的样品与标准品同时进行反应，将扩增曲线得到的Ct值代入标准曲线，就可以得到未知样品的绝对量。 相对定量 相对定量方法相对复杂，一般用于基因表达分析。 首先应分别测定目的基因和参比基因的量，再求出对于参比基因的目的基因的相对量，最后再进行样品间相对量的比较。 * * 扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团 荧光检测元件 Rn (荧光信号) 线性增长期 指数增长期 平台期 扩增曲线 PC