葡聚糖凝胶层析法分离蛋白质、.ppt

Vt的测定: Vt为柱床体积，可用下式计算： Vt=π(D/2)2 × h 式中，π为常数3.14，D为柱直径，h为凝胶床的高度。 在实验中, 如何测定Vt? Ve 与 Vo Vi 之间的关系为: Ve = Vo + Kd Vi 其中: Kd-样品组分在流动相和固定相之间的分配系数. 也可视为 不同分子量组分在凝胶颗粒内部和外部的分配系数. 它只与被分离组分的分子量大小及凝胶颗粒孔径大小和凝胶颗粒间空隙有关;与柱的长短和粗细无关. Kd 可通过实验测定. 分配系数 Kd =（Ve － Vo）/ Vi Kd 可以有下列几种情况： (1)当Kd=O时，则Ve=Vo，即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质(全排阻)，洗脱容积等于空隙容积(组分I)。 (2)当Kd=1时，Ve=Vo+Vi，即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱容积应为空隙容积与内容积之和(组分Ⅲ)。 (3)当0Kd1时,Ve=Vo+KdVi,即表示组分不同大小可部分进入凝胶颗粒内部(组分II) 1 有效分配系数Kav 已知 Kd=（Ve-Vo）/Vi，将Vt-Vo代替Vi， 则Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo） 即 Ve=Vo+Kav（Vt-Vo） Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。 在一般情况下，凝胶对组分没有吸附作用时，当流动相流过Vt体积后，所有的组分都应该被洗出来，这一点为凝胶层析法的特点 Vt = Vo + Vi+ Vg = Vo + Vi Kd =（Ve － Vo）/ Vi Ve = Vo + Kd Vi Kav = （ Ve － Vo）/ （Vt —Vo） Ve = Vo + Kav（Vt-Vo） 层析柱（1×20cm）；梯度混合仪；恒流泵；部分收集器；连接管等 葡聚糖G-50（ SephadexG-50 ） 样品：蓝葡聚糖-2000、重铬酸钾混合液（各1mg/ml） 洗脱液：纯水 三．器材和试剂 1.装柱 ． 装柱是最关键的一步。 重力沉降法装柱 陆续不断地添加糊状物，使其形成的胶粒床面上有胶粒连续均匀地沉降，直至装柱物完全沉降至适当的柱床体积为止。 柱的表面始终要保持着一层溶剂(一般l～3cm柱高)柱的任何一部分绝对不能“流干”。 四. 操作方法 层析柱的形状，一般直径 与高度的比为l：15为宜。 柱形必须根据层析介质和 分离目的而定。待分离物 质的性质相近，柱越细长， 则分离效果越好，但流速 较慢。在样品组分并不复 杂的情况下，采用“矮胖柱”. 要求:垂直 柱面平 无气泡 无节痕 松散 均匀 灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度，不能时断时续，否则将出现分层或“纹路”等毛病。若在灌好胶后才发现“纹路”、分层等现象时，要重新装柱，以免影响层析效果。 层析柱正式使用前，必须平衡至所需的pH和离子强度，一般使用前用相当于柱床体积2-3倍的洗脱液流过凝胶柱，以压实凝胶，稳定柱床，称为平衡。 检查柱是否均匀，可用蓝色葡聚糖2000，在恒压下走柱，如色带均匀下降，说明柱是均匀的，可以使用，否则应重新装柱. 在平衡期间可调流速. 2.平衡 3.加样 要求:样品体积和浓度不变(1.0ml) 有3种方法可将样品加到已制备好的柱顶： 1.简单的方法是放除柱床表面以上的溶液，但切忌液面低于凝胶表面。然后将样品加在凝胶表面，打开柱下口开关， 使样品慢慢渗入凝胶内。加样时注意勿将凝胶柱面冲起形成凹面，也不能沿管壁流下， 当慢慢渗入凝胶的样品液液面与凝胶柱面相平时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一层（1～2cm柱高）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱。 2.不需要让柱流干至床表面，而是加入1％浓度的蔗糖来增加样品的密度； 3.方法是用一个毛细管和一个注射器或蠕动泵把样品直接传送到柱表面(如一些商品柱附有专门加样装置)。 保持柱上端胶面平整、柱内无气泡和胶床不干裂十分重要。为此，除加样时注意不破坏胶面平整外，在整个层析过程中，应在胶面上端保留合适体积的洗脱液(约1-2 cm柱高)，避免洗脱液滴人柱内时，破坏胶面的平整或可能造成胶床干裂。 4. 洗脱 收集 打开层析柱下口开关，洗脱液即可流出进 行洗脱。按 1 ml/min收集洗脱液（加样 及开始收集）。每1分钟换1管，直到黄 色流完为止。 5．检测 用+来表示颜色的深浅：+ ++ +++等。 6. 绘制洗脱曲线 以洗脱体积为或洗脱管为横坐标，纵坐标为颜色的深浅，绘制洗脱曲线。 蓝葡聚糖凝胶-2000和重铬酸钾的洗脱体积：Ve蓝和Ｖe重。 －柱外水体积Ｖo －