4 基因工程的支撑技术.ppt

生物技术与应用 重组DNA技术与基因工程的基本概念 A 重组DNA技术的基本定义 B 基因工程的基本定义 C 重组DNA技术与基因工程的基本用途 D 基因工程的基本形式 D 基因工程的基本形式 A 重组DNA技术的理论基础 B 基因的分子生物学 C 基因工程的基本原理 D 基因工程的支撑技术 A 用于核酸操作的工具酶 B 用于基因克隆的载体 C 用于基因转移的受体菌或细胞 l 噬菌体生物学特性： 生物结构 5’ TCCAGCGGCGGGG 3’ 3’ CCCGCCGCTGGA 5’ COS COS cos 头部合成基因 尾部合成基因 溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因 阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重组基因 删除与整合基因 l - DNA 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l 噬菌体生物学特性： 感染周期 E.coli 吸附 LamB受体 注入 复制 包装 裂解 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l 噬菌体生物学特性： 感染周期 体内包装 100个左右的拷贝 包装范围为原DNA的75 - 105% 即 36 - 51 kb D A 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l 噬菌体生物学特性： 溶原状态 l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态 DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：缩短长度 野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体： 插入型载体 取代型载体 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体 体外包装 插入位点 体外包装 插入片段 载体长度 37 kb 插入片段大小： 0 - 14 kb （51 – 37） 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体 体外包装 体外包装 插入片段 最小装载长度 10 kb （51 – 26） 载体长度 26 kb 插入片段 最大装载长度 25 kb （36 – 26） 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点 野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不 利于重组操作，必须删除至1 - 2个 同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一 些单一的酶切位点 除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶 位点 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：加装选择标记 与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此 加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容 l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类： 免疫功能类标记 颜色反应类标记 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：加装选择标记 imm434 imm434基因编码一种阻止l-噬菌体 进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记 基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶 原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑； 当外源DNA插入到标记基因中，基因灭 活， l-重组分子便进入溶菌循环，形成 透明斑 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的构建：加装选择标记 lacZ lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化 无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基 因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能 合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产 生蓝色透明斑 噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA l-DNA载体的主要类型： 插入灭活型载体 Charon2、Charon6、lgt11 取代型载体 lEMBL4、lgtlc、lNM762、Charon40 正选择型载体 lEMBL1、lL47、l1059 野生型的l噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+）， 这种生长抑制表型受l-DNA上的re