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免疫新技术在科研中的应用 厦门大学医学院 高丰光 抗原或抗体的检测 抗原抗体反应的特点 抗原抗体反应的影响因素 常用的抗原抗体反应 抗原抗体反应的特点 高度的特异性 可逆性 抗原抗体结合除了空间构象互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水键等分子表面的化学基团之间的非共价方式结合。这种非共价键不如共价键结合稳定，极易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离。 抗原抗体比例影响免疫复合物的大小 抗原抗体反应的两个阶段 抗原抗体反应的影响因素 抗原抗体浓度与比例 电解质 抗原抗体特异性结合后，亲水性降低，易受电解质的影响而使表面失去较多的负电荷。 温度 适当的温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会，加速抗原抗体复合物的形成。 酸碱度 抗原抗体反应的最适pH在6—8之间，pH过高或过低，即过碱或过酸，均可影响抗原、抗体的理化性质。 常用的抗原抗体反应 凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术 凝集反应 直接凝集反应 血型鉴定 肥大反应 间接凝集反应 间接凝集抑制试验 微粒捕获酶免疫分析技术 间接凝集反应 将可溶性抗原或抗体吸附在与免疫无关的颗粒载体上，形成致敏颗粒，再与相应抗体或抗原进行反应产生的凝集反应，称为间接凝集反应。 颗粒载体有红细胞、聚苯乙烯乳胶颗粒、活性炭颗粒，而相应的凝集现象分别称为间接血球凝集、间接乳胶凝集、间接炭粒凝集反应。 微粒捕获酶免疫分析技术 将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物素—亲和素—酶放大系统相结合，最后酶作用于荧光底物，使之发荧光，通过检测荧光强度判断待测抗原的含量。 检测肿瘤标记物CAl99、CEA、CAl25、AFP、性激素、甲状腺素T-T+、叶酸、HIV抗体、HCG等微量可溶性抗原。 沉淀反应 速率散射比浊法／免疫比浊法 琼脂扩散法 单向琼脂扩散 双向琼脂扩散 火箭电泳 对流免疫电泳 免疫印迹技术 速率散射比浊法／免疫比浊法 将已知抗体与相应抗原在液相中按一定比例混合形成可溶性免疫复合物，这些复合物微小粒子对一定波长的光照射发生散射，可通过三个光路系统测定光散射(OD值)。 抗体含量固定并处于抗体过剩时，免疫复合物的多少直接取决于抗原的浓度，抗原的终浓度通过标准品绘出的标准曲线查出。 提高了灵敏度，通过自动化，可同时检测多个样品并进行精确的定量分析。 检测前白蛋白、酸性蛋白酶、巨球蛋白、转铁蛋白、尿微量蛋白及IgG、IgM、IgA及补体，药物含量分析。 免疫印迹技术 将用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE分离得到的按分子量大小排列的非标记蛋白转移到固相载体膜上，再用标记的特异性的抗血清或单克隆抗体对蛋白质进行定性及定量分析的技术，其鉴定蛋白质的敏感性为1—5ng。 检测可溶性抗原、细胞成分的鉴定与分析，检测与自身变性细胞核成分结合的抗体(抗核抗体)，HIV的明确诊断。 免疫印迹法的基本步骤 电泳分离蛋白抗原，SDS是一种阴离子去污剂，与蛋白质牢固结合，十二烷基磺酸根带负电荷，使样品中各种蛋白质与SDS形成SDS-蛋白质复合物，由于蛋白质表面均带有相同密度的负电荷，使分子构型几乎相同(线性)。因此SDS中，SDS多肽复合物的电泳迁移率只与其分子质量有关，而不受所带电荷及分子形态的影响。 将SDS分离到的蛋白条带转移至固相的硝酸纤维素膜上。 蛋白条带可用酶、同位素标记的一抗或二抗进行特异性反应，加入显色底物或放射自显影以显示结果。 免疫标记技术 免疫酶测定法 免疫荧光技术 放射免疫测定法 免疫胶体金技术 免疫酶测定法 是一种用酶标记一抗或二抗检测特异性抗原或抗体的方法。 将抗原—抗体反应的高度特异性与酶对底物的高效催化作用有效地结合起来，通过酶分解底物产生有色物质(也可作用于荧光底物，产生荧光)，肉眼观察颜色深浅或酶标仪测定光密度值(OD)，以反映抗原或抗体的含量。 本法灵敏度高，检测可溶性抗原或抗体、组织或细胞表面特异性抗原。 ELISA 双抗体夹心法(sandwich assay) 检测血清、脑脊液、胸、腹水等各种液相中的可溶性抗原 间接法 测定细胞及组织表面抗原 酶联免疫斑点试验(enzyme—linked immunospot assay，ELISPOT) 用已知细胞因子的抗体包被固相载体，加入待检效应细胞，温育一定时间后洗去细胞，如待检效应细胞产生相应细胞因子，则与已包被的抗体结合，再加入酶标记抗该细胞因子抗体，加底物显色。 一般选择硝酸纤维素膜(NC)或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜覆盖微量反应板作为固相，在分泌相应细胞因子的细胞所在局部呈现有色斑点，一个斑点表示一个分泌相应细胞因子的细胞，通过计数可推算出分泌某种细胞因子细胞的频率。 免疫荧光技术 用荧光素标记一抗或二抗，检测特异性抗原或抗体的方法。 常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(nuorescein isothiocyanate，FITC)、藻红蛋