ISHprotocol熒光原位杂交技术实验方案.docVIP

地高辛标记寡核苷酸，荧光标记二抗，ISH，冰冻切片操作过程： 多甲固定：应尽量在半个小时内完成。（固定时间以24-36小时为宜，避免RNA降解或固定过度。） 切片:为获得高杂交信号，冰冻切片应切成10um-20um。（选用16um）（切好的片子可以保存在-70度中）但是要注意，保存在-70度中的切片，拿出来以后，立即在4%的多甲中重新固定，避免在重新固定前切片恢复室温。（重新固定10-15min） 用0.1MPB洗切片3*5min 切片放入100%乙醇5min，空气中干燥。 杂交液：（20ml） 藏于-20度 20*SSC 4ml 硫酸葡聚糖 4g 去离子甲酰胺 10ml 将他们溶解后，加入以下物质： Poly A（10mg/ml） 0.5 ml SsDNA（10mg/ml） 0.5 ml tRNA （10mg/ml） 0.5 ml DTT (1M) 2ml 50*Denhardts 0.2ml 上述溶液可以配置后长期贮藏与-20度中，用前预热到37度。 杂交溶液：将地高辛加入杂交液中，探针的浓度需要摸索（一般是100ng-1000ng/ml，一般是以200ng/ml为起点来摸索条件），所加的杂交液的体积看切片的大小来决定，对于2cm*2cm的组织，一般是加50ul，但是对于嗅球，可