硕士研究课－现代分子生物学－电子克隆.pptVIP

Genomic DNA Sequence Source /blast Rice /rice http://rgp.dna.affrc.go.jp WEBSITE FOR GENE PREDICTION http://www.ebi.ac.uk/genemark/ / /genome/exons.html * 电 子 克 隆 电子克隆： electronic cloning ----硅片克隆 In silico cloning----电子杂交 electronic hybrid 电子克隆： 定义： 利用计算机技术，依托现有的网络资源EST数据库、核苷酸数据库、蛋白质数据库、基因组数据库等，采用生物信息学方法 包括同源性检索、聚类、序列拼装等 延伸EST序列，以期获得部分乃至全长cDNA序列的一种方法。 EST walking 基于染色体DNA序列的电子克隆 1、EST expressed sequence tag ---表达序列标签 定义： 指从不同组织来源的对应于mRNA的cDNA文库中随机挑选克隆进行5’或3’端测序后得到的部分cDNA序列，长度一般在300～500bp。 EST技术是基于cDNA文库基础上的cDNA克隆的部分序列测定。 EST技术的步骤： ① 构建cDNA文库 ② 随机挑选cDNA克隆 ③ 碱裂解法或扩增制备模板 ④ 序列分析 ⑤ 与同种和异种生物已知的核酸和蛋白数据库进行比较分析 ⑥ 新基因及未知基因的基因库 Gene Bank 登录 2、电子克隆的方法和策略 1）方法 选择感兴趣的EST作为查询探针，对EST两端进行测序； 根据两端序列查询dbEST数据库，找到部分重叠的EST同源序列，进行拼接、得到EST重叠群 EST contig ； 以长度≥100bp，同源性50%以上、85%以下为标准 以拼接好的EST contig为新的查询探针，继续搜索dbEST库，直到没有新的EST可供拼接为止，获得全长的基因编码序列。 获得的EST序列数据，与GenBank核酸数据库进行相似性检测； 假如没有精确匹配基因，将EST序列数据按EST六种阅读框翻译成蛋白质，接着与蛋白质序列数据库进行比较分析。 可根据拼接好的完整序列设计PCR引物，通过RT-PCR的方法获得目的cDNA克隆并进行序列测定验证。 5’ 3’ est Search in est database Search in est database Search in est database Search in est database 5’ 3’ Complete cDNA 简单电子克隆模式图 est walking est walking的技巧 1. 如何鉴定片段重叠和筛选最佳目的est 2. 选择合适的片段用于检索est文库 EST同源性分析 AU184451 RICR2584A 99AS825 D004D07 C25822 RICS1291A AAAAAA D004D07 AAAAAA 99AS825 AU184451 RICR2584A C25822 RICS1291A ATG TAA Rice root Oryza sativa cDNA clone R2345, mRNA sequence est walking 的优点和局限 优 点： 快速，无须实验操作 局 限： 1. est库不均一； 2. est库测序精度不高（最高为97% ） 3. est库中有不完全剪切产物 CLONE INFO Clone Id: S20127_2Z DNA type: cDNA RIMERS PolyA Tail: Unknown SEQUENCE GATATGCGGCTANTATAGCCAGCATGCCATATGAGGGGCTTTTAGCATTAGAAGAGCAGA TTGGNGATGTAAATACTGGTCTGGCAAAAAGCTACATTGTAGAGAAATTGAAGACTAGCT TATTTGTNCCAGGATCATCCTGCATGTCTAATAAGTCTTCTGAATCTTCCATGGAGAATG ATGCTTGCATAATATGCCAGGAAGAGTATCAGGTTAAAGAATGCATTGGAACCCTTGACT GTGGCCACAGGTACCACGAAGATTGCATAAAACAATGGTTGATGGTAAAGAATTTATGCC CCATCTGCAAGACGACAGCTTTGTCAACCGGAAGAAGAAGTGGATAACGAACAGGAATAA TCTTATTAGTTATTTACTTCCGACAAATATTCAGCTCAATTTTGTA