第八章植物原生质体培养及细胞融合课件.pptVIP

33 第八章 原生质体培养与细胞融合 第一节 原生质体培养 一、 原生质体的培养概况 1、概念： 植物的原生质体(Protoplast)指除去细胞壁以后的裸露细胞。 原生质体培养（Protoplast culture）是将游离的原生质体进行培养，通过细胞的分裂与分化，形成完整植株的过程。 植物细胞壁上的DNA酶活性较高，当引入外源DNA时，细胞壁上核酸酶对该DNA破坏作用很大。原生质体培养可以避免细胞壁的阻隔，利于细胞器的移植或大分子物质的引入。 原生质培养首先在烟草上获得成功NagataTakebe（1971），到1993 有49个科，146个属的320多种植物培养成功，得到再生植株。 2、意义 1、可将外来遗传信息通过不同基因载体（噬菌体、细菌质粒）引入植物细胞，使细胞性状在分子水平上发生变化，再生出具有新性状的植物。 2、通过异源原生质体融合，充分组合核质基因组，进行植物品种的改良,创建新品种及种质。 3、以原生质体为材料，并进行体细胞遗传、远缘杂交不亲和机理等方面的研究。可进行细胞生物学、植物生理学、遗传学、分子生物学等方面的研究。 二、原生质体的分离和纯化 1 原生质体的分离 叶肉组织是制备原生质理想的材料，遗传性状一致。 细胞壁主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质等。 分离原生质的方法主要有以下两种： （1）机械法： ①首先将细胞放在高渗的糖溶液中（水势低），使细胞发生质壁分离（细胞失水），原生质体收缩成球状； ②破碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。 缺点：获得的原生质体少、产生的原生质体的细胞类型受到限制。最早在19世纪末，利用机械法分离藻类原生质。 一般取材局限于具有液泡化程度较大的细胞或长形细胞的组织。但可避免酶制剂对原生质体的某些破坏作用。 （2）酶解法 采用多糖水解酶将细胞壁降解而获得原生质的一种方法。 常用于降解细胞壁的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶（离析酶）、蜗牛酶、和胼胝质(pianzhi)酶等。 1960年，cocking证实了用酶解法由高等植物细胞中大量分离原生质体的可能性。 EA3—867纤维素酶，为中国上海植生所纤维素酶小组从野生型绿色木霉通过诱变处理获得的一个酶活性较高的突变菌株。日本R-10纤维素酶，使用于初生壁细胞。 优点：可以获得大量的原生质体，适用于几乎所有植 物和器官。 缺点：酶制剂含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶及酚类物 质，会影响原生质体的活力。 2 影响原生质体数量与活力的因素 细胞壁降解酶的种类和组合:一般植物细胞使用(纤维素酶0.7-1%,果胶酶0.5-1%),花粉细胞和四分体小孢子,可使用蜗牛酶和胼胝质酶。 渗透压的稳定剂种类:甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等，如甘露醇一般为0.5-0.7M。 原生质膜稳定剂 (CaCl2、0.1mM,葡聚糖硫酸钾 0.2-0.3%) pH影响 5.4-6.0 3 原生质体的纯化（净化） 指将酶解后的溶液中的原生质体与组织残渣（如去未脱壁的细胞、细胞碎片）分开的过程。 (1) 沉降法 原理：利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中进行过滤离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。 首先将含有原生质体与酶混合液过网筛（44～169μm孔径），除去叶脉大组织块。然后低速离心（900～4500r/min）收集沉于底部的完整的原生质体。 一般叶肉原生质体均采用沉降法，优点是采集方便，缺点是不能完全除去少量的细胞和破碎的原生质体。 (2) 悬浮法（漂浮法） 原理：采用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后，使原生质体漂浮于溶液表面，而残渣碎屑沉淀于底部。 加0.5M蔗糖溶液，原生质体浮于表面，取出浮于表面的原生质体，反复操作。 这种方法可收集较纯的原生质体，原生质大小较一直，但获得原生质数量少，而且高渗溶液对原生质体有害，收集较沉降法困难。 (3) 界面法 原理：利用两种比重不同的溶液，使完整的原生质体处于两液相的界面之中。 在离心管中依次加入一层溶于培养基中的500 mm /L蔗糖，一层溶于培养基中的140mm/L蔗糖和360mm/L山梨醇，最后一层加入悬浮于酶溶液中的原生质体（含有300mm/L山梨醇、100mm/LCaCl2）,轻轻混合，经5℃, 400g条件下，离心5min，完整的原生质体悬浮在两层液体之间，叶绿体和破碎原生质体均在下面液体中，取出界面中的原生质体，按上述方法再重复进行一次。 界面法的优点：可收集到较大的纯净的原生质体，同时避免收集过程中原生质体的破损。 三、原生质体培养方法 (1) 固体培养法（平板