钙离子的检测方法和钙离子检测的应用.doc

细胞内Ca2+的检测方法和钙离子检测的应用 摘要：Ca2+是细胞内重要的第二信使，与多种生命活动相关，在动物、植物、微生物的生命活动中发挥至关重要的作用。随着对Ca2+功能认识的深入，Ca2+开始在生命科学的研究中发挥重要作用，对Ca2+浓度的测定方法也在不断发展，Ca2+的浓度指标或者浓度的变化可以作为许多生理现象的指标。本文主要介绍几种重要的Ca2+的检测方法并举例说明钙离子的检测在研究中的广泛应用。 关键词 ：Ca2+、检测方法、荧光Ca2+测定、应用 前言 Ca2+是细胞内重要的阳离子，Ca2+在人体的组织细胞及亚细胞器正常的生理功能中发挥着重要的生理功能，如细胞的分泌、肌肉收缩、卵子受精、神经传导、个体发育、细胞凋亡等生理病理过程，Ca2+是关键的调控信号。在细胞内Ca2+以结合态和游离态两种形式存在，细胞内Ca2+的分布和转移是形成Ca2+信号的基础。细胞内Ca2+的改变，通过不同的信号通路、细胞器以及跨细胞依赖过程的幅度和周期来调节细胞过程。只有游离Ca2+的才能发挥生理作用[1]。因此要准确的分析钙在生命活动中的作用，就必须精确的测量钙离子的瞬时变化。本文主要讲述现在主要的检测钙离子的方法和钙离子检测在研究中的应用。 一、检测细胞内钙离子浓度的方法 1、钙离子选择性微电极测定法 钙离子选择性微电极是一种电化学敏感器 它是利用内充液和组织或细胞之间产生电位差，理想情况下，该电位差是钙离子对数的线性函数，遵循Nernst方程。该方法的优点是不需要使用指示剂，缺点是穿刺损伤细胞可引起渗漏[3]。 2、同位素示踪法 同位素示踪法主要用于跨膜Ca2+的流动，可以检测到Ca2+通过细胞膜转运到细胞内的浓度及速度大小。利用Ca2+的同位素对其进行放射性同位素示踪，放射性同位素作为示踪剂可以检测到1.0×10-18-1.0×10-19的放射性核素，灵敏度很高，缺点放射性示踪剂在细胞内的分布可以达到分子水平。该方法的缺点是对静息状态Ca2+的不敏感，而且同位素示踪剂有一定的放射效应，应十分注意。 3、核磁共振法 具有无损伤性特征的核磁共振法是一种非光学技术的Ca2+测定方法。在检测时需要使用含氟指示剂。目前主要用到的含氟指示剂是nF—BAPTA。通过检测具有快交换性质的5F-BAPTA结合与未结合Ca2+的峰面积或慢交换性质的结合与未结合Ca2+的4F-BAPTA 的化学位移来计算钙离子浓度。该方法能在近生理状态下检测Ca2+的变化，缺点是成本太高。 4、荧光Ca2+测定技术 这是目前应用最广泛的检测Ca2+在胞内分布及变化情况的方法。这种方法得益于荧光指示剂的发展。检测Ca2+的荧光指示剂有很多种，根据激发光的波长，可以分为紫外光激发的荧光指示剂和可见光激发的荧光指示剂，具体的选择可以根据自己的实验特点进行，荧光指示剂法可以将Ca2+检测的实验与其他技术结合使用，如可以与流式细胞仪、荧光分光光度计、或者荧光显微镜进行联合检测 。紫外光型主要包括Quin2、Indo1、Fura2等，数量较少，可见光型数目较多，包括Fluo3、钙绿、Rhod2等。荧光指示剂根据测光原理和数据处理的性质又可以分为比值型和非比值型两种类型。其中Fura2、Benzothiaza、Indo1和BTC等系列属于比值型,化学荧光指示剂大都为非比值型染料。 虽然比值型荧光染料较少，但应用广泛。下面介绍几种典型的荧光染料的特点。 Fura2 属于双波长激发指示剂，其激发特性与Ca2+浓度有关，当介质中没有Ca2+时，其激发峰为380nm，当与钙结合时，激发峰向短波方向340nm处移动，最后分别以340nm、380nm激发,得到发射光的比例，这种比例与细胞内Ca2+浓度成正比例的关系，这种染料可以减少染料负载，增强结果的准确性。 Fura2 与双波长显微荧光分光光度计联用可以测量单细胞内Ca2+的浓度，与流式细胞仪联用可以测定细胞悬液的Ca2+的浓度 ，与荧光分光光度计联用测量单细胞内及细胞悬液钙离子的浓度，因为其结果准确，而且不易被漂白，所以是广泛使用的指示剂。 Indo1 是双波长发射指示剂，单波长激发（340nm）和双波长发射（405nm和506nm）,也可以用荧光比率来反应细胞内Ca2+的浓度。它的优点与Fura2相似，但其漂白作用明显，应用时应该尽量减小狭缝宽度和尽量减少激发光照射时间。 目前最新的荧光指示剂是第三代荧光指示剂Fluo-3,是典型的单波长指示剂，激发波长位于可见光范围内。最大吸收峰位于506 nm,最大发射波长是526 nm，Fluo-3与Ca2+结合后其荧光强度比游离时高出40倍左右，从而避免了细胞自身的荧光干扰。作为长波长指示剂，Fluo-3可以用作激光共聚焦成像研究，或者与其他荧光指示剂