生物制药论文-组织型纤溶酶原激活剂.docVIP

1　引言（或绪论） 组织型纤溶酶原激活剂(Tissue Type Plasminogen Activator, t-PA)激活纤溶酶原形成纤溶酶，是体内纤溶系统的生理性激动剂，在人体纤溶和凝血的平衡调节中发挥着关键性的作用，是一种新型的血栓溶解剂。t-PA在组织和体液中含量甚微，分子量很大，从天然组织提取或人工合成药用t-PA均有很大难度。本实验运用基因工程手法，从人胎盘染色体基因库中筛选出TPA基因，将其雨质粒结合，导入到人黑色素瘤细胞当中，组建能够表达t-PA基因的工程细胞。然后将人黑色素瘤细胞无血清连续培养，并运用高效诱导剂，从而快速、大量地获得了含组织型纤溶酶原激活剂(tPA)水平较高的培液。经免疫亲和层析、Sephadex G-150凝胶过滤，培液中t-PA得以快速有效地纯化。将纯化后的tPA与WHO标tPA抗体作免疫鉴定。 2　组织型纤溶酶原激活剂简述 2.1组织型纤溶酶原激活剂 原激活剂(PA)是以丝氨酸为活性中心的蛋白酶。它能将纤溶酶原转化为纤溶酶，在纤溶系统中有重要作用。同时，PA与细胞转移、血液凝固、组织重建、激欣产生及原发性肿瘤的发生等生理和病理生理现象有密切的关系。 人纤溶酶原激活荆有尿激酶型（uPA）及组织型(tPA)两种主要类型。这两种蛋白质免疫性不同，分子量有区别，由不同的基因编码。 tPA主要是由血管内皮细胞合成的单链多肽，分子量约为68000，在纤溶酶或胰蛋白酶作用下，水解Arg275-Ilu276肽键，形成由二硫键连接的双链结构。氨基末端在重链，羧基末端在轻链。重链有两个三角区结构，并有与纤维结合素指形结构有同源性的区域和生长因子样区域等。轻链含有由His(322)}、Asp（371）、 Ser （478）组成的酶活性中心。 tPA对纤维蛋白原亲和力很低，对纤维蛋白亲和力极高,. tPA-纤维蛋白复合物能高效且特异地激活血凝块中的纤溶酶原，形成纤溶酶，后者溶解血栓中的纤维蛋白，但几乎不激活循环血液中的纤溶系统，因此，tPA是一种较为理想的血栓溶剂。 2.2　组织型纤溶酶原激活剂基因 1983年，Pennia等成功地构建了编码tPA的完整cDNA克隆，并在大肠杆菌中进行了表达。该克隆的tPA ds- cDNA的限制性内切酶位点，也同样出现在tPA基因中。 Ny的tPA基因，用限制性内切酶水解，琼脂糖凝胶电泳，与tPA探针作Sou-there固相分子杂交，然后将阳性片段克隆到M13，mP8mP9中，进行顺序分析，显示了有以下结构特征； tPA基因至少由13个内含子分隔为14个外显子，每一个内含子5端以G-T开始，3’-端以A-G结束。 tPA基因的14个外显子，分别编码tPA各个功邻区域。 2.3　tPA基因的染色体定位 tPA基因以单拷贝存在于染色体中。1985年，Rajput等人用人-鼠体细胞融合，进行基因转移，研究tPA与uPA基因的染色体定位。 他们用限制性内切酶Hind}I分别消化人和鼠染色体DNA，将水解片段与tPA cDNA探针杂交，结果为tPA探针与人DNA/Hind耐班的强杂文带为7kb，与鼠DNA/HindⅢ的强杂交带为23kb。 然后他们随机选择了32个不同的融合细胞，其细胞DNA/Hind与tPA探针杂交的结果为:32个细胞中都有23kb条带，18个细胞中尚有7kb强杂交带。其余24个融合细胞中7kb强杂交带消失。进一步作染色休组型核型鉴定发现:含有7kb杂交条带的18个融合细胞中都有第8对染色体，而24个不含7kb条带的融合细胞中均不存在第8对染色体。因此证明人SPA基因定位于第8对染色体t 7 7。用同样的方法，他们又确定了人uPA基因定位于第10对染色体。这个结论与过去提出的PA基因定位在第6对染色体是不相同的。 3　t-PA工程细胞的制备 3.1　tPA cDNA探针的制备 本设计采用改良的Birnboim方法。大量制备tPA cDNA片段的重组质粒pHS-2，经Sepharose 2B柱分离，获得纯化质粒。Pst水解pHS-2质粒，经1%琼脂糖凝胶电泳分离并回收其中tPA cDNA片段，按NBN公司切口平移翻译药箱推荐的反应条件，以α-32P CTP标记tPA cDNA片段，用液体闪烁计数仪测定探针的放射性强度，计算比放射性。 3.2　人胎盘染色体基因库优选 将人胎盘染色体基因库重组DNA随机分为7个组份，每份取一定量用EcoRI消化2h，经碱变性后与tPA cDNA探钦点杂交，探针强度为5 x 105-106cpm/ml杂交液，50℃杂交(5 xSET；5 x Denhardts；0.1NapyPO4；O,1%SDS；10%Na-Dextran sulfate，鱼精DNA100-200ug/ml杂交液