用QIAGENRNeasyPlantMini试剂盒提取总RNA(胍盐法)操作步骤.docVIP

用QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒提取总RNA（胍盐法）操作步骤 1、称取新鲜叶组织样品100 mg，液氮速冻。 2、在预冷的研钵中研磨成细粉，转移到2 ml离心管中。注意研磨不彻底则会造成严重产量降低。 3、待液氮挥发（但不能解冻）后，加入450 ml提取缓冲液RLT，涡旋混匀，并在56℃温育1~3 min。注意：最好在RLT临用前加入1/100体积的14.5 M β-巯基乙醇，加后保存时间不超过1个月，RLT溶液应在1个月内使用。对于高淀粉含量的材料，可将温度提高到60℃以上防止淀粉结块。 4、将裂解液加到离心柱（淡紫色柱）上，下接一个2 ml收集管，最大转速（10000 g）离心2 min。如果将裂解液粘稠，可切去吸头顶端，用大口吸头吸取。裂解液通过柱子时被均质化，大部分组织碎片都被截留在柱子表面，只有少部分通过柱子形成沉淀，因此，应小心吸取上清液，转移到另一新离心管，不要吸细胞碎片残渣沉淀。 5、加入0.5倍体积（225 μL）96~100%乙醇，吹打混合均匀。如果裂解液有损失，则相应减少乙醇用量。加入乙醇后，可能会出现沉淀，但对提取无影响。 6、将混合液全部（包括沉淀675 μL）转移到吸附RNA的离心柱（粉红色柱），下接一个2 ml收集管，大于8000 g或10000 r/min离心15 sec。如果混合液体积超过700 μL，每次只加700 μL到离心柱上，按上述条件离心。弃去管内液体，重复使用收集管。 7、加入700 μL洗脱液，大于8000 g或10000 r/min离心25 sec，弃去收集管。 8、将离心柱转移到一新的2 ml收集管上，加入500 μL RPE液，大于8000 g或10000 r/min离心15 sec。弃去管内液体，重复使用收集管。注意：试剂盒提供浓缩的PRE洗脱液，所心使用前必须加入4倍体积的96~100%乙醇，成为工作液。 9、加入500 μL RPE液到离心柱上，最大转速离心2 min，干燥离心柱，弃去收集管。残留乙醇会干扰随后的反应，这次离心要保证无乙醇残留。若有乙醇残留，以最大转速离心1 min。注意：小心移去离心柱，不要接触管到液体，以防止携带乙醇。 10、把离心柱连接到一新的1.5 ml收集管上，加入20~30 μL 无RNase水，大于8000 g或10000 r/min离心1 min，洗脱RNA。若RNA产量在20 μg以上，用30~50 μL无RNase水再洗脱一次。RNA样品存于－20℃或－80℃冰箱。 11、分光光度计测定RNA。开启紫外分光光度计，预热30 min。用DEPC处理水校正零点。用DEPC处理水稀释RNA样品30~50倍，将稀释液转移到比色杯中。读取230、260、280、310 nm的OD值。计算出样品浓度和OD比值。OD260/ OD280比值应为1.7~2.1，低于1.7，说明有蛋白质或酚污染；OD260/ OD230比值应大于2，低于此值，说明有糖、盐、胍等小分子污染。 12、琼脂糖凝胶甲醛变性电泳。首先制备凝胶（1.2%）。称取1.2 g琼脂糖，加72 ml DEPC处理的水，加热溶化。冷却至60℃，在通风橱内加入10×凝胶缓冲液10 ml，甲醛（37%）18 ml，混匀后倒胶。然后制备样品。在离心管中，将RNA样品与5×变性上样缓冲液按4:1比例混匀。65℃温育5~10 min，迅速在冰上冷却5 min，瞬时离心数秒。上样前凝胶须预电泳5 min，随后将样品加入上样孔。以5 V/cm电压电泳1.5~2 hr。待溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3~4/5处结束电泳。将凝胶置于溴化乙锭溶液（0.5 μg/mL，用0.1 mol/L乙酸胺配制）中当色约30 min。紫外灯下观察结果。 在含有强的异硫氰酸胍变性剂的提取缓冲液中裂解植物组织粉末。在提取缓冲液中包含RNase酶抑制剂，抑制RNase活性并确保RNA的完整性。通过第一次离心柱时细胞碎片阻留在柱上，溶液被均质化，包括RNA在内的小分子物质通过离心柱，加入乙醇后，再经过第二个离心柱，RNA就结合在底部有硅胶的膜上，洗去其他杂质，最后用无RNase水溶出RNA，该柱子最大可结合100 μg大于200 bp的RNA，小分子RNA如5.8S、5S、tRNA将会丢失。每个柱子所用起始材料最多为100 mg，可分离30~70 μg的总RNA。由于不同发育阶段和不同组织所含RNA不同，可以调整起始材料用量，如果组织含有RNA较少，可用100 mg，若RNA含量较高，则起始材料应小于100 mg。即使总RNA含量未达到柱子吸附最大值，起始材料太多时，由于裂解不彻底，同样导致RNA产量和纯度降低。如果总RNA含量超过100 μg，柱子也只能回收100 μg以下的RNA。对于胚乳等一类组织，