SiRNA介导乳动物基因沉默1.docVIP

siRNA介导哺乳动物基因沉默 1 导言 在人类基因组（30亿bp）中，约有3－4万个编码蛋白的基因，但一半以上基因的功能仍不清楚。一项全新的技术—siRNA（small interfering RNAs）技术—已用来系统研究数以千计的基因功能及相互关系。SiRNA是RNAi的介导者之一，它通过dsRNA使同源基因沉默。用siRNA去沉默脊椎动物基因，尽管一年前才见报道，但对绝大多数脊椎动物基因功能的分析仍显示出了强大生命力。 2 RNAi的发现 2.1基因功能的分析策略 经典的正向遗传学是依赖突变体而分析基因的功能，但随着基因组测序的巨大进展，仍有数以千计的基因功能不为人们所知。反向遗传学是当今研究基因功能的最有效手段，但目前还没有一项通用的反向遗传学技术，人们只是通过对目的基因进行同源重组来分析其功能，实验周期长而且花费巨大。而最新的RNAi 技术可使目的基因沉默，是反向遗传学的一次伟大变革。 2.2 RNAi的发现 1998年，当时线虫基因组测序工作业已完成，Andrew Fire和Craig Mello提出了一项新技术：通过dsRNA诱导特异基因的沉默，即所谓RNAi。这一发明与先前的dsRNA介导植物体内的PTGS相似。Fire和Mello等指出，在线虫体内，哪怕存在几个分子的dsRNA，也足以使与其同源的基因的表达完全受阻。这一研究掀起了以RNAi介导线虫基因沉默的热潮，不仅如此，该技术在哺乳动物中的应用正如火如荼。人们不仅用RNAi来研究基因的功能，甚至还用它来治疗一些病毒引起的疾病。 3 SiRNA简介 3.1 siRNA的发现 在1999年，Andrew Hamilton 和David Baulcombe发现，在拟南芥的转基因株和病毒诱导的PTGS中，存在21－25nt RNAs，该RNAs与沉默基因序列互补，其来源是较长的dsRNA前体。还有研究表明，21－23nt的dsRNA，携带2nt 3′突出末端。这些小RNA决定了RNAi的特异性。在果蝇的基因沉默细胞中，提取到的小分子RNA，足以使原初胚胎胞容物及S2细胞的基因表达沉默。这些小分子RNA即称siRNA。 3.2人工合成的 siRNA 人工合成的21nt和22nt dsRNA也可高效诱导胞溶物中特异的mRNA的降解。人们一直努力去合成一些具有活性的siRNA。由于化学合成法造价昂贵，有人利用T7噬菌体聚合酶在体外合成siRNA：一种方法是用该酶分别转录siRNA的正义链和反义链，之后再退火以形成siRNA；另一种方法是用T7 聚合酶直接转录顺式连接的siRNA的两条链，以形成发夹结构。值得注意的是，T7 聚合酶体外合成的siRNA都具有5′三磷酸末端结构，而在果蝇中，siRNA活性必需的结构是5′一磷酸末端。因而，在哺乳动物中，要么其5′三磷酸 需转化成5′一磷酸，要么其5′端的结构要求并不严格。还有人利用纯化的细菌RNaseⅢ，在体外加工较长的dsRNA以产生siRNA。 4 stRNA简介 4.1 stRNA的发现 研究生物体内基因表达调控的一个新策略始自线虫中lin-4和 let-7 RNA的发现。这两种RNA均来自于70nt具发夹结构的前体RNA，经加工形成22nt 的RNA。在线虫和蠕虫中，lin-4和 let-7的基因均与发育的时序性有关，一旦突变，都会引起异时序性的发育缺陷。如蠕虫的lin-4突变体停留在幼虫期而不再向前发育，而let-7突变体则滞留于幼虫的最后一次蜕皮期。 4.2 lin-4 RNA lin-14和lin-28 mRNA编码发育过程中的重要蛋白，而lin-4则对其进行负调控。lin-4 RNA与lin-14和lin-28等重要的发育调控的3′－UTR的特定序列同源。一旦删除这些mRNA的3′－UTR，会发生发育失控的表型。靶mRNA的Northern blot 分析结果表明，调控者（如lin-4，很可能包括let-7 RNA）可能稳定地与多核糖体结合，从而引起了靶mRNA在翻译水平的沉默。 4.3 let-7 RNA let-7 RNA结合于lin-41（另一种重要的发育调控基因）mRNA 3′－UTR上并进行负调控。let-7 RNA的序列在两侧对称的哺乳动物中高度保守。 2000年，Amy Pasquinelli等将lin-4和let-4称作stRNAs small temporal RNAs ,并指出，更多的stRNAs仍有待发现。 5 stRNA和siRNA的共同调控 5.1 Dicer 与stRNA和siRNA stRNA和siRNA有共同的大小，暗示它们在介导基因沉默过程中的可能联系。遗传学的证据表明，Dicer联系着这两个过程。有两个RNaseⅢ结构域，一个RNA解旋酶区和一个dsRNA结合区。Dice