提取酵母细胞壁聚糖的新方法.doc

提取酵母细胞壁中B-D-葡聚糖的新方法 摘 要 研究了一种从酵母细胞壁中提取B-D-葡聚糖的新方法,包括高温抽提、脱脂和酶解3部分。在高温条件下分别考察了pH、料液比、温度及时间对B-D-葡聚糖得率和纯度的影响。结果表明,高温提取的最佳工艺条件为:料液比为1B15、pH 8、温度120e,时间3 h,B-D-葡聚糖得率为61105%,纯度达到41151%;为了进一步提高B-D-葡聚糖的纯度,采用了脱脂和酶解的方法去除粗多糖中的蛋白质、脂质等杂质,最终产品的纯度达到78131%。 关键词 B-D-葡聚糖,酵母细胞壁,提取 B-D-葡聚糖是一种极富生物活性的多糖,具有较 强的免疫及抗肿瘤活性。在酵母细胞壁中含有大量 的B-D-葡聚糖。目前该资源主要是作为饲料廉价销 售,造成资源浪费,利用现代科技手段从酵母细胞壁 中提取B-D-葡聚糖是实现其综合利用的有效措施。 传统的提取方法有酸法、碱法、酸碱结合方法,但提取 条件都较为剧烈,且酸碱试剂易腐蚀设备,环境污染 严重,尤其是在提取过程中部分B-D-葡聚糖会降解, 造成产品得率与生物活性的降低。本文采用了一种 较为温和的提取B-D-葡聚糖方法,包括高温抽提、脱 脂和酶解3部分,操作过程简便、快速,易于大规模生 产,更为重要的是避免了酸碱条件对产品带来的降解 作用,同时副产物甘露聚糖是动物营养与免疫研究和 应用中的主要功能性多糖,因而具有一举两得的效 果。 1 材料与方法 111 仪器 Waters 600高效液相色谱仪 配置Waters 600四 元输液泵, 2410示差折光检测器, 7725 i进样阀, Empower色谱工作站 ;高压灭菌锅 上海第一医疗 器械厂 ;QT-1漩涡混合器 上海琪特分析仪器有限 公司 ;德国ChristALPHA 1-4LSC冷冻干燥机 北京 鑫盛鸿阳科技有限公司 ;Avanti J-26XP系列高效离 心机 贝克曼库尔特商贸 中国 有限公司 。 112 试剂 酵母细胞壁 安琪酵母有限公司提供 ,蛋白酶 Protamex、Savinase、Neutrase、Alcalase 214L 丹麦No- vozymes公司提供 ,Protex40L Genencor公司提供 , 胰蛋白酶和CP酶 复合蛋白酶 无锡杰仁生物科技 公司提供 ,所有化学试剂均为分析纯。 113 B-D-葡聚糖的提取 高温提取:用缓冲液配成一定质量浓度的酵母细 胞壁悬浮液于250 mL三角瓶中 加入直径015cm玻 璃珠 ,分别在不同pH、时间、温度、料液比下进行高 温抽提,离心,沉淀用水洗涤3次,冷冻干燥,得到水 不溶性粗多糖,备用。 脱脂:取得到的水不溶性粗多糖,按照1B20 gBmL 的比例分别与不同的有机溶剂配成悬浮液, 不同有机溶剂为:V 正己烷 BV 甲醇 4B1、异丙 醇、石油醚、无水乙醇、正己烷等,加热回流5 h,进行 脱脂处理,反应结束后得到脱脂粗多糖, 40e真空干 燥,备用。 酶解:脱脂得到的粗多糖经酶解脱去残余蛋白 质,采用的蛋白酶有:中性蛋白酶Neutrase、碱性蛋白 酶Savinase,Alcalase 214T及Protex 40L、复合蛋白酶 Protamex、胰蛋白酶和CP酶等,反应结束后,得到的 残渣用水洗涤3次,离心,再加水复溶后于100e加 热5 min灭酶,离心,真空干燥,得到淡黄色粉末即为 B-D-葡聚糖产品。 114 B-D-葡聚糖含量的测定 H2SO4水解:准确称取100 mg左右酵母细胞壁 粉末 B-D-葡聚糖产品或其中间产物粗多糖 于25 mL具塞试管中,加入115mL 72% H2SO4,漩涡混匀, 室温静置3 h,然后加入一定浓度阿拉伯糖溶液作为 内标物,再加入去离子水使H2SO4的最终浓度为1食品与发酵工业FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES 190 2011 Vol137 No11 Total277 mol/L,充氮气,真空封管, 100e水解5 h,取出冷却至 室温,用Ba OH 2中和,离心,得上清液A,用水洗涤 3次,合并A和所得洗涤液,最后定容至100 mL,过 滤后用HPLC进样检测。 色谱条件:色谱柱: Sugar-Pak 1 615 mm i1d1@ 300 mm;流动相:超纯水;流速: 014 mL/min;柱温: 85e;检测:示差折光检测器。 B-D-葡聚糖含量的计算:称取一定量的内标物, 加入到葡萄糖中组成标准品溶液,然后将相同量的内 标物加入到同体积的样品溶液中组成样品溶液,将2 种溶液分别进样,根据下述公式计算得到样品中葡萄 糖的含量再乘以葡聚糖的转换系数019,得到样品中 葡聚糖的含量。 Ai/As 样品 Ai/As 标准 Ci% 样品 Ci% 标