13薄层色谱法精读.pptVIP

* * §7-3 薄层色谱法 ? 薄层色谱法的特点 ? 比移值Rf及其影响因素 ? 薄层板的制备 ? 薄层色谱的实验方法 §7-3 薄层色谱法 7.7.1 方法原理 固定相：固体吸附剂（硅胶、活性氧化铝、纤维素、聚酰胺 等）。制成糊状，均匀涂在平滑的玻璃板上，涂层 厚度约0.25mm。 流动相：有机溶剂 分离机理：吸附分配 根据试样中不同物质在吸附剂固定相和展开剂溶液间的分配系数不同而进行分离的。混合物中各组分在两相中经反复的吸附或分配，从而使各组分分开。 7.7.2 薄层色谱法的特点 （1）快速 作一次薄层色谱需要10分钟至1小时，而纸色谱则需要数小时至十几小时 （2）分离效率高 其每秒钟的有效塔板数比柱色谱高10~100倍 （3）灵敏度高 其可检测出0.01微克的物质，比纸色谱灵敏100倍 （4）可用各种方法显色，可以喷强腐蚀性的浓硫酸，可以高温灼烧。这些是纸色谱办不到的 （5）应用范围广 选择不同的薄层材料，可作吸附色谱，分配色谱，离子交换色谱等。点放样品的负荷量也比纸色谱大，薄层色谱的操作比较方便。 缺点 薄层的质量好坏，影响Rf的重现性 边缘的展开剂，移动速度快，出现所谓的边缘效应 色谱不易保存 7.7.3 比移值Rf 及其影响因素 1、薄层色谱中Rf的定义 a表示溶质A区带中心移动的距离，与流动相中溶质的溶解度成正比 b表示从取代中心至溶剂前沿的距离，与固定相中溶质的溶解度成正比 2、影响比移值的因素 （1）主要取决于被分离物质的情况 与选择固定相、流动相有关，与被分离物质在流动相、固定相的K有关 （2）展开时温度 由于展开时间短，温度影响较小，温度低时展开速度慢，但分离效果好 （3）薄层厚度 当其厚度 0.1毫米时，厚度增加，Rf下降；当其厚度 0.2毫米时，厚度增加， Rf下降速度下降。当薄板厚度增加到0.25mm时，活化层为0.15mm时，分离效果最好。 （4）吸附剂含水量的影响 不仅对Rf影响较大 ，而且还影响分离原理 。吸水量较小时，原理为吸附色谱；含水量大时，则为分配色谱。 （5）层吸缸中溶剂饱和度 不饱和层吸缸中展时Rf较大 7.7.4 薄层色谱常用的吸附剂和展开剂及其选择原则 氧化铝、硅胶、硅藻土、纤维素等，材料的选择要依据采用何种层析方法。 （1）氧化铝：一般用于吸附薄层层析，其吸附活性大于硅胶。 “干板” （软板）—— 通常用是用Ⅱ ~ Ⅲ 级活性氧化铝，200~300目， 铺层时不加粘合剂，直接用干粉铺层。 “硬板”—— 5~20%的煅石膏作粘合剂（此时称氧化铝G）加水调成糊状，在玻璃板上涂布，活化后使用。 （2 硅胶：用作吸附薄层、分配薄层均可。硅胶的机械性能差，必须加入粘合剂。一般用硅胶的颗粒为200~250目，采用Ⅱ级活性硅胶，通常加适量水，调成糊状，用涂布器涂于玻璃板上使用。 3 硅藻土：通常用作分配色谱。用于分离碳水化合物，氨基酸等。也可单独适用，也可加15%煅石膏后使用。 4 纤维素粉：与滤纸性质相似，但分离时间短，用来分离生物碱核酸等；与纸色谱相比，斑点浓集分离时间短。 在吸附剂中加入粘合剂的目的： 使吸附剂牢固地吸在薄层板上，而不至于脱落。 种类： 煅石膏 —— 耐腐蚀，但其机械强度差，展开时易脱落。 淀粉 —— 机械强度高，但不能在含有碘蒸气中显色。 羧甲基纤维素 —— 机械强度高，耐腐蚀性差。 5、展开剂的选择 要考虑被分离物质的极性、吸附剂的活性及展开剂的极性这三者之间的关系来选择合适的展开剂。 例如： 非极性物质B，选用吸附剂的活性为Ⅰ~Ⅱ级，展开剂应为非极性的。 选择何种展开剂，要通过实验来确定。 6、薄层板的制备 干法制板和湿法制板 （1）薄层载片的制备：洁净、干燥 （2）制备浆料：制成的浆料要均匀，不带团块，粘稠适当。为此，应将吸附试剂慢慢加到溶剂中，边加边搅拌。如果将溶剂加至吸附剂中常常会出现团块状。加料完毕，剧烈搅拌，最好用广口瓶，旋紧盖子，将瓶剧烈摇动，以保证充分混匀。 （3）浆料的铺开方式：平铺法、倾注法、浸涂法 平铺法： 倾注法 将调好的浆料倒在玻璃板上，用手左右摇晃，使表面均匀光滑，然后，把薄层板放于已校正的平面的平板上阴干。 浸涂法 将载玻片浸入盛有浆料的容器中，浆料高度约为载玻片长度的5/6，使载玻片涂上一层均匀的吸附剂。 （4）薄层的活化 薄层涂好后，于室温下放置10~30min，风干后放于架子上。 在烘箱内，100~110°C保持30~60min活化，活化温度高十几度，时间长十几分钟，但影响不大，但是，加入石膏脱水失去固着力。而分配色谱硅胶中的水分起着固定相的作用，不许加热活化，于室温下12小时后即可使用。作反相色谱时，把硅胶、聚四氟乙烯等担体和相应的固定相液体混合，铺成薄层