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《功能基因与调控》试题 顺式作用元件与反式作用因子有什么区别? 1.1顺式作用元件 存在于基因旁侧与结构基因串联的特定DNA序列，是转录因子的结合位点，它们通过与转录因子结合而调控基因转录的精确起始和转录效率。顺式作用元件本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。顺式元件可分为以下四种类型：①核心启动子成分，如TATA框；②上游启动子成分，如CAAT框，GC框，ATF结合位点；③远上游元件：如增强子，沉默子等；④特殊启动子成分：如淋巴细胞中的Oct和KB。这些元件都为不同的转录因子及蛋白质识别和结合来调节转录。 1.2反式作用因子 反式作用因子是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。大多数真核转录调节因子由某一基因表达后，可通过另一基因的特异的顺式作用元件相互作用，从而激活另一基因的转录，这种调节蛋白称反式作用因子。反式作用因子通过以下不同的途经发挥调控作用：①蛋白质和DNA相互作用；②蛋白质和配基结合；③蛋白质之间的相互作用以及蛋白质的修饰。参与基因表达调控的因子,它们与特异的靶基因的顺式元件结合起作用。编码反式作用因子的基因与被反式作用因子调控的靶序列 基因 不在同一染色体上。 反式作用因子有两个重要的功能结构域:DNA结合结构域和转录活化结构域,它们是其发挥转录调控功能的必需结构。反式作用因子可被诱导合成,其活性也受多种因素的调节。同一类序列特异性的反式作用因子由多基因家族所编码。与转录水平调节的反式作用因子通常可分为四大类：①RNA聚合酶；②和RNA聚合酶相联系的普遍性转录因子，它们结合在靶基因的启动子上，形成前起始复合物， 启动基因的转录；③特异性转录因子 如激活因子和抑制因子 ，一类与靶基因启动子和增强子 或沉默子 特异结合的转录因子，具有细胞及基因特异性，可以增强或抑制靶基因的转录；④种类多样的协调因子，要么改变局部染色质的构像 如组蛋白酰基转移酶和甲基转移酶 ，对基因转录的起始具有推动作用，或直接在转录因子和前起始复合物之间发挥桥梁作用 如中介因子 Mediator ，推动前起始复合物 PIC 形成和发挥作用。包括：1.DNA结合域：a.螺旋-转角-螺旋；b.锌指结构；c.亮氨酸拉链d.螺旋-突环-螺旋；2.转录激活域：与其他转录因子相互作用的结构成分。随着表观遗传学的发展，研究发现除了蛋白，DNA、RNA也有调控功能，所以现在也称反式调控元件，主要有miRNA，转录因子等。 请分别设计研究顺式作用元件、反式作用因子以及两者之间相互作用的实验。? 2.1全长启动子序列获得 premier 5.0 walking技术 提取RNA-反转生成 cDNA-引物设 5’和3’侧翼序列 （包括启动子 2.2生物信息学分析与预测 获得启动子序列后, 首先通过生物信息学方法对启动子序列进行初步的预测和分析,分析序列中含有的可能的相关顺式作用元件。常用的植物启动子预测相关数据库和软件资源包括：EPD、TRRD、TRANSFAC、PLACE、Plant CARE突变分析法是鉴定顺式作用元件最可靠的方法, 多数突变分析包括缺失突变和取代突变。 5 端缺失法、3 端缺失法 内部缺失法 分析确定功能启动子的调控区边界 确定重要顺式作用元件 点突变法 精确的点突变 获得启动子顺式作用相关元件。 2.4 凝胶阻滞分析法 凝胶阻滞依据的原理就是在凝胶电泳中,由于电场的作用,小分子DNA片段比其结合了蛋白质的DNA片段向阳极移动的速度快,依据电泳迁移率的变化可以确定蛋白质与核酸分子的结合情况。凝胶阻滞实验常用于研究启动子功能元件与核蛋白的结合情况,从而鉴定新的顺式作用元件或验证已知顺式作用元件与转录因子的相互作用。 2.5 确定与蛋白质结合的DNA 的长度及序列 DNase I足迹分析法其基本原理是用DNase I部分消化已进行单链末端标记的待测双链DNA,在变性聚丙烯酰胺凝胶上形成以相差一个核苷酸为梯度的DNA条带；当DNA片段与其特异性结合的蛋白结合后,结合蛋白的区域受到蛋白的保护, 免受 DNase I 的攻击, 因此形成切割梯中的空白区域。再结合DNA化学测序法,就可知该结区的碱基序列。 2.6 顺式作用元件与反式作用因子作用研究 酵母单杂交体系从酵母双杂交技术发展来的。该方法根据DNA 结合蛋白 即转录因子 与DNA顺式作用元件结合调控报告基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因、鉴别已知转录因子的DNA结合位点, 是一种利用酵母细胞来进行 的体内遗传分析系统。。其原理是: 转录因子通常由一个DNA结合结构域和一个转录激活结构域组成。理论上, 任何一个AD都可以与任何一个BD结合并激活转录, 而且只要二者能够通过一定方式在空间上足够靠近, 就可激活