酶工程02酶的生产.pptVIP

（1）间歇发酵 先在适于菌体生长的条件下进行培养，然后再转入适于产酶的条件下进行发酵，可以将菌体的生长条件区别对待，并根据各阶段的特点提供相应的最适条件，所以产酶率高，同时营养物质和诱导物质浪费很少。 平板培养的要点 单细胞悬浮液的制备：将要培养的材料诱导形成愈伤组织，再把它或器官组织用酶法或机械振荡培养法游离出单细胞，然后用适当大小孔径的不锈镍网过滤，除去残渣和多细胞团块，滤液即为细胞悬浮液。 悬浮细胞密度的调制：首先利用血球计数板法记数每ml悬浮液中的细胞数。然后调制细胞密度，一般的平板培养要求细胞密度为103~105个/ml 琼脂培养基的配制： 一是直接配制1.4%琼脂培养基 二是配制条件培养基，其配制方法：首先把已进行一段时期亲本细胞培养的液体培养基，离心沉淀细胞材料，取上清夜一份同灭菌的1.4%琼脂培养基一份趁热充分混匀，即为0.7%琼脂条件培养基。 平板的制备：取已知细胞密度的单细胞悬浮液1份，与熔化状态（35℃ 的0.7%琼脂培养基2~4份充分混匀，倒入各个灭菌的培养皿中，制成3mm厚的琼脂培养基平板，盖上皿盖后密封。 培养：将平板置约26 ℃和黑暗下培养。 植板率：用来反映植板效率的高低，其含义是已形成细胞团的单细胞与接种总细胞数的百分数。 微室培养法 微室培养法是在无菌小室中培养接有单细胞的培养液小滴，使细胞得以生长和繁殖成单细胞无性系的无菌培养方法。它是为进行单细胞活体连续观察而建立的一种微量细胞培养技术。 Torry法 Jones法 陆文梁法 微室培养法优点 操作简便； 能进行活体连续观察； 培养效果好等优点。 （四）植物器官培养系统 应用于生产次生产物的植物器官：体细胞胚、毛状根、不定芽、幼苗等。 烟草转化 （1）烟草叶片的无菌处理 取温室生长的烟草叶片，流水下冲洗掉表面杂物，再用蒸馏水洗涤；70%的乙醇灭菌30秒后，无菌水冲洗一次；2.5%次氯酸钠处理8-10分钟；无菌水冲洗三次，备用； （2）无菌的烟草叶片切去边缘和主要叶脉，切成0.4?0.6cm2大小； （3）切好的外植体在农杆菌菌液中浸泡10分钟； （4）用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入上铺一层滤纸的MS基本培养基，28?C暗培养； （5）三天后，将材料转到含有抗生素的分化培养基（MS+3mg/l 6-BA+0.2mg/l NAA+ Kan 100?g/mL + Cb 500?g/mL）中进行培养； （6）待抗性芽生长至2-3cm高时，切下小芽转入生根培养基中诱导生根，生根培养基配方：MS基本培养基+ Kan 100?g/mL + Cb 500?g/mL。 （二）酶合成的诱导作用 加进某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的过程叫酶合成的诱导作用，简称诱导作用，起诱导作用的物质叫诱导剂。如乳糖诱导β半乳糖苷酶的合成；淀粉诱导α－淀粉酶的合成等 （三）酶生物合成的反馈阻遏作用 这种作用又称产物阻遏作用，指酶催化作用的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受阻的过程，引起反馈阻遏作用的物质叫共阻遏物。如无机磷酸是碱性磷酸酶催化磷酸单脂水解的产物，而它的过量存在却可以阻遏碱性磷酸酶的生物合成；组氨酸作为组氨酸合成途径的终产物，它的过量积累可反过来对其合成途径中的10种酶的生物合成均起反馈阻遏作用。其机理与诱导机理相似。 在无共阻遏物时，调节基因R产生的阻遏蛋白与操纵基因O的亲和力弱，不能与O结合，所以已经结合到P上的RNA聚合酶能顺利通过O到达结构基因位置，进行转录，进而合成酶蛋白;当共阻遏物达到一定浓度时，阻遏蛋白与共阻遏物特异结合，使其结构改变，从而使阻遏蛋白与操纵基因亲和力增强，当阻遏蛋白结合到操纵基因上时，就阻止RNA聚合酶的通过，结果无法转录结构基因，使酶合成受阻。 二 打破酶合成调节机制的方法 酶合成调节机制的意义在于：它能保证机体最经济、最有效地将体内的合成原料和能量用于合成生命最需要的物质。但是从应用的目的出发，如能设法打破这种机制，某些酶的产量就可大幅提高，从已经报道过的试验数据来看，在采取相应的措施后，参与分解代谢的酶类产量，可能有上千倍的变化，而参与合成代谢的酶类，则可有上百倍的变化，如何打破这种机制？可从内外两方面进行考虑： （1）遗传控制：包括基因突变和基因重组。 （2）控制条件：包括添加诱导物和降低阻遏物浓度。 （3）其他方法：如添加表面活性剂，产酶促进剂等。 （一）通过条件控制提高酶产量 1.添加诱导物： 这一方法显然只适用于可诱导的酶类，但产生的效果十分显著，关键是选择适宜的诱导物和诱导物浓度。 诱导物包括： （1）酶的作用底物，但有些底物并不是诱导物。 以前认为，诱导物应该是酶的底物，但事实上，底物不一定都有诱导作用，相反不能作为底物的有时却能诱导酶的大量产生。现在的认识是：强有力的诱导物一