色层分离法解析.ppt

12 色层分离法 Chromatography 主要内容 1概述 2色层分离法的产生和发展(基本概念及色谱展开技术) 3色层分离的有关术语 4各类不同分离机制的色层分离法介绍 5色层分离过程理论 6层析的放大 1. 概述 色层分离，又叫色谱法、层离法、层析法等。 色谱法是利用不同溶质（样品）与固定相和流动相之间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的差别，当两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次平衡，使各溶质达到相互分离。 固定相，通常为表面积很大的或多孔性固体； 流动相，液体或气体。 2. 色层分离法的产生和发展 1903年 俄国植物学家 Tsweet茨维特 植物提取液 CaCO3玻璃柱石油醚淋洗 色谱法（chromatography） 填充CaCO3的玻璃柱管叫做色谱柱 具有大表面积的CaCO3固体颗粒称为固定相(stationary phase) 推动被分离的组分(色素)流过固定相的惰性流体(上述实验用的是石油醚)称为流动相（mobile phase） 在柱中出现的有颜色的色带叫做色谱图（chromatogram）。 色谱法（chromatography） 色谱分析法实质上是一种物理化学分离方法，即利用不同物质在两相(固定相和流动相)中具有不同的分配系数(或吸附系数)，当两相作相对运动时，这些物质在两相中反复多次分配(即组分在两相之间进行反复多次的吸附、脱附或溶解、挥发过程)从而使各物质得到完全分离。 分离介质 足够的亲水性，保证有较高的收率 足够大的多孔性，使大分子能透过 有足够强的刚度，可在大生产中使用 良好的化学稳定性 能引入各种功能团 2.2 基本概念及其分类 色层分离是基于当含有被分离物质的料液渗滤通过有吸附剂离子涂铺的层(薄层层析)或填充的管子(柱层析)时，对混合物各组分产生选择性的阻滞作用。 固定相 固体或是包埋在惰性固体里的液体 移动相 气体 (GC) 或液体 (LC) 需要离析的样品 纸层析法是分离鉴定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。 柱层析分离法的有关装置 4、色层分离法介绍 吸附色层分离法　基于溶质分子与固定相作用的机理不同；利用吸附剂对组分的吸附能力的差别进行分离 用来填充柱的物质包括无机吸附剂和有机吸附剂。 无机吸附剂 磷酸钙 二氧化钛 氢氧化锌 氧化铝凝胶 澎润土等；静电相互作用 特异结合位点 有机吸附剂　大网格吸附剂 聚酰胺等 应用于亲水性发酵产物的分离 2.3 亲和层析 2.3.1亲和作用的本质 具有亲和作用的分子（物质）对之间具有“钥匙”和“锁孔”的关系，这是必要条件。除此以外，还需要分子或原子水平的各种相互作用，才能完整地体现亲和结合作用。 a. 静电作用 b. 氢键 c. 疏水性相互作用 d. 配位键 e. 弱的共价键 2.3亲和层析 利用生物体内存在的特异性相互作用的分子对而设计的层析方法。 2.3.2 原理与操作 亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相分离法。 2.3.3 亲和吸附介质 2.3.3.1 亲和配基 a. 酶或酶的抑制剂 b. 抗体或抗原 c. A蛋白：A蛋白与IgG有很强的亲和作用。A蛋白存在于黄色葡萄球菌的细胞壁中。 d. 凝集素（lectin） 凝集素是与糖特异结合的蛋白质的总称。不同的凝集素与糖结合的特异性不同。如：ConA与葡萄糖和甘露糖的结合作用较强；麦芽凝集素与N-乙酰葡糖胺的亲和作用较强。 2.3.3.1 亲和配基 e. 辅酶和磷酸腺苷 脱氢酶的辅酶——NAD、NADP 激酶的辅酶——ATP AMP、ADP与上述辅酶的结构类似。 f. 三嗪类色素 三嗪类色素是一类分子内含有三嗪环的合成活性燃料，与各种需要在NAD的存在下表现其生物活性的脱氢酶和激酶具有结合作用，还与血清白蛋白、干扰素、核酸酶、糖解酶等具有很高的亲和力。 2.3.3.1 亲和配基 g. 过渡金属离子 h. 肝素 肝素与脂蛋白、脂肪酶、抗凝血酶、凝血酶、FGF等蛋白质具有亲和作用 2.3.2 载体 将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面即可制备亲和吸附介质，该固体粒子通常称为配基的载体。 2.3.2.1. 对载体的要求 1）非专一吸附要小、高度亲水、惰性。 2）具有大量可供活化和配基结合的化学基团。有稀松的网状结构使大分子能自由进入。 3）有较好的化学稳定性和对酶及微生物侵蚀稳定，有良好的机械性能，颗粒均匀。 2.3.2.2 载体简介 1）多孔玻璃载体 玻璃对酸碱、有机溶剂及生物侵蚀非常稳定，并且本身又特别坚硬，易于化学键合安装分子臂，是一极为理想的载体。 但由于目前价格昂贵，而且有时呈现SiOH基的非特异性吸附，这是最大的缺点。由于其