肿瘤生物治疗实室常用实验方法.doc

肿瘤生物治疗实验室肿瘤生物治疗实验室常用实验方法 1 总RNA的提取（Trizol法提取） 2 PCR 3 RT-PCR 5 琼脂糖核酸电泳 7 胶回收纯化DNA 8 大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法） 9 乙醇沉淀DNA 9 酶 切 10 连 接 10 感受态细胞的制备 11 转 化 12 重组子的筛选和鉴定 13 真核细胞的转染 13 转染细胞的稳定筛选 14 重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量 15 肿瘤细胞体外传代培养及保种 16 肿瘤动物模型的建立 17 小鼠尾静脉注射方法 18 肿瘤蛋白疫苗预防性动物实验 18 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养 18 实验动物免疫方案 19 血清制备 20 ELISA 20 血清学筛选克隆新抗原/新基因 21 ELISPOT 25 藻酸盐包裹实验 25 重组腺病毒构建，扩增及纯化基本技术操作 26 组织病理技术 31 免疫组化染色 33 流式细胞仪常用的几种检测方法 35 Western Blot(免疫印迹法) 40 电泳分离（参照SDS电泳方法） 41 PVDF膜上蛋白的可逆染色 43 人肿瘤抗原的识别与鉴定 46 蛋白质组实验流程 47 双向电泳的样品的制备 48 双向电泳操作步骤 49 SDS胶染色 51 双向电泳蛋白点的切取和保存 52 数据库搜索(Databases search) 53 主要的公共数据库及网址 54 Mascot 54 MOWSE 54 Peptide Search 54 Protein Prospector 54 Prowl 54 EXPASY中国镜像站点（BI peptident） 54 双向电泳常见问题与原因 54 IEF 54 SDS, staining 55 蛋白质的序列分析流程 56 聚丙烯酰胺凝胶的配制 58 双向电泳常用溶液配方 59 总RNA的提取Trizol法提取在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。 提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打以裂解细胞； 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中，在室温（15℃～30℃）下放置5分钟； 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟； 取上层水相置于新EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟, 12000g（2℃～8℃）离心10分钟； 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清； 让沉淀的RNA在室温下自然干燥； 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。 PCR 实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM和PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。 按下列组成在PCR反应管中调制反应液： TaKaRa TaqTM或TaKaRa EXTaqTM的配方 Reagent Quantity, for 50μl of reaction mixture 10X PCR buffer （Mg2+ free） 5 μl MgCl2（25mM） 如TaKaRa TaqTM加3 μl 如TaKaRa EXTaqTM加4 μl 2.5mM dNTP mix 4 μl 10μM Primer 上游 1 μl 10μM Primer下游 1 μl Template DNA 1 μl Taq或EXTaqDNA Polymerase