醋酸纤维薄膜电法分离血清蛋白实验报告.doc

前言 血清蛋白： 血清蛋白是血液中脂肪酸的携带者。当身体需要能量或者需要建造材料时，脂肪细胞就把脂肪酸释放到血液中 ，脂肪酸被血清蛋白获取，并被运送到需要的部位。 牛血清白蛋白的相对分子质量为10的4次方这个级别，它不是一定的，是多聚物，有的地方测的70 000，这就是一个数据了。在做PCR的时候会用到它。 牛血清蛋白是血液的主要成分，分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。 醋酸纤维薄膜电泳 醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、廉价。已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋 白，甲胎蛋白，类固醇激素及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。 1.（1）醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性。 （2）快速省时。由于醋酸纤维薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45—60min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。 （3）灵敏度高，样品用量少。 血清蛋白仅需2μl血清，甚至加样体积少至0.1μl，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。 （4）应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。 （5）醋酸纤维薄膜电泳染色后，经冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。 2、醋酸纤维薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，操作简单，但分离效果不太好。如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只能分离出5—6条区带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数10条区带。 三、实验材料及试剂 1、实验器材 1. 电泳仪：为电泳提供直流电源。 2. 电泳槽：为电泳提供场所。 3. 血清加样器 ：可用盖玻片或微量加样器。 4. 醋酸纤维素薄膜：2cm×8cm 其它： 培养皿（直径9-10cm）、滤纸、镊子等 2、实验材料及试剂 材料：牛血清 1.巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6) 2.0.5% 氨基黑10B染色液 3.漂洗液 4.透明液：临用前配制 甲液：取冰乙酸（AR）15ml，无水乙醇（AR）85ml，。  乙液：取冰乙酸（AR）25ml，无水乙醇（AR）75ml。 5.保存液：液体石蜡 6.定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液） 实验步骤 1、电泳槽的准备 电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥。点好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上。 2、醋酸纤维素薄膜的润湿 将醋酸纤维素薄膜完全浸泡于缓冲液中约30min后，用镊子小心夹住薄膜一端，放在折叠的滤纸中，并用滤纸吸干表面液体。 3、点样 把膜条铺在玻璃板上（无光泽面朝上），将点样器在血清中沾一下（量薄薄一层为好），再在膜条一端1.5-2cm处轻轻水平地落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。此步是实验的关键。 4、电泳 将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上(见下图)。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。 连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强度0.3mA/cm膜宽度电泳时间约为1h。电泳后，关闭电泳仪切断电源。 5、染色： 电泳完毕后将薄膜取下, 放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5-10min。（染色液回收） 6、漂洗： 将薄膜从染色液中取出,自来水下冲洗除去多余的染色液后放入盛有漂洗液的培养皿中漂洗，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱 。 7、透明 将脱色吹干后的薄膜浸