GhWRKY3,anovelGossypiumhirsutumLWRKYgene,isinvolvedindiversestressresponses技术总结.ppt

GhWRKY3, a novel cotton (Gossypium hirsutum L.) WRKY gene,is involved in diverse stress responses Ruoyu Guo ? Feifei Yu ? Zheng Gao ?Hailong An ? Xuecheng Cao ? Xingqi GuoReceived: 19 December 2009/Accepted: 5 March 2010/Published online: 18 March 2010? Springer Science+Business Media B.V. 2010 背景 在整个生命周期中，植物遇到各种生物和非生物胁迫。在进化中，植物已经产生了一系列复杂的响应机制，并具有通过多种信号通路感知和响应各种外部信号的能力。植物激素是多种信号通路的重要组成部分，它们通过协同或拮抗作用共同调节植物生长，发育和防御反应。 转录调控机制在植物发育和环境刺激的反应中也发挥了作用，WRKY蛋白是这些转录因子成员之一，它代表一个锌指转录因子的大家族。 WRKY蛋白参与了多种非生物的防御反应和发育过程，如寒冷和干旱胁迫，伤害和次生代谢产物的生物合成 棉花（陆地棉）是一种重要的经济作物。虽然从棉花中鉴定了许多基因，如Ghcdh 等，但有关于WRKY转录因子是否参与介导致病菌和棉花信号激素的反应没有报告。在本研究中，我们从棉花中分离出了一种新的WRKY基因，GhWRKY3，编码一个假定的I组WRKY蛋白。GhWRKY3组成型表达在根，茎和叶。SA，ABA，MeJA，ET，GA3和H2O2能使GhWRKY3的转录上调。此外，GhWRKY3的表达也受伤害和三种真菌病原体包括立枯丝核菌，炭疽菌和枯萎菌感染诱导，但不受6-BA，NAA，干旱，盐，和冷（4°C）的诱导。 1、植物材料、生长条件和处理 棉花种子在28°C时发芽，然后28°C.时幼苗16 h光/暗8小时周期在温室养殖培。组织表达特异性分析：取同一植株苗期的根，茎和叶，零下80°C液氮冷冻保存。 a、幼苗叶片分别喷洒2mM SA，100μM ABA ， 100μM茉莉酸，乙烯释放乙烯利5mM，500μM GA3，10μM NAA ，20μM 6-BA，和10mM H2O2。幼苗用无菌水对照。 b、损伤，冷和盐的处理按高等人的协议。[ 22 ]。 c、干旱胁迫用15% PEG6000的灌溉幼苗进行。 d、真菌病原处理：幼苗的根系分别蘸水稻纹枯病，炭疽病棉蚜和尖孢镰刀菌、枯萎病菌分生孢子悬浮液106孢子每毫升。 各种处理下的叶片在适当的时间的收获，在液氮中冷冻，并在零下80°C储存 2、提取RNA、cDNA合成和DNA制备 提取RNA 用Trizol试剂从植物组织提取总RNA，并用无核糖核酸酶DNaseI处理去除潜在的基因组DNA污染。 cDNA合成 The first-strand cDNA was synthesized with the EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (Transgen, China) according to the manufacture’s protocol DNA制备 基因组DNA用CTAB法从幼叶分离。 3、GhWRKY3内部保守序列的扩增 获得内部保守片段，引物WP1和WP2根据拟南芥，香菜，烟草和甜马铃薯WRKY蛋白的保守氨基酸设计合成。 RT-PCR进行如下： 94°C 5分钟 35个周期的94°C 40秒 50°C 40秒 72°C 1分钟 延伸72°C 10分钟 纯化并克隆PCR产物到pMD18-T载体 转化到大肠杆菌感受态细胞测序。 4、3′ and 5′ RACE of GhWRKY3 3′RACE以第一链cDNA为模板，特异引物为3WP1 / 3WP2。第一次PCR是通过特异引物3WP1和通用引物B26进行的。PCR产物稀释十倍后与嵌套引物3WP2 和通用引物B25进行二次PCR。第一次PCR和巢式PCR反应进行了如下：预变性94°C 5分钟，35个周期的94°C 40秒，50 / 52°C 40秒， 72°C为90秒，在72℃最后延伸10分钟。纯化并克隆二次PCR产物到pMD18-T载体，然后转化大肠杆菌感受态细胞进行测序。 5′RACE，第一链cDNA的纯化是通过向导DNA清理系统。然后，纯化的cDNA在5′端采用末端脱氧核苷酸转移酶基因进行多聚腺苷酸化。