蛋白质浓度测定方法.ppt

测量后的计算方法 使用 一 实验结果 　　　求出待测蛋白质溶液的光密度后，从标准曲线上查出其蛋白质浓度，按稀释倍数求出每毫升蛋白质溶液的蛋白质含量。 讨论 每种方法的适用范围 每种方法的影响因素 还有无其他方法 * 四种古老的经典方法： 定氮法 双缩尿法（Biuret法） Folin－酚试剂法（Lowry法） 紫外吸收法 新的测定法： 考马斯亮蓝法（Bradford法） 更新的测定方法： BCA法 分光光度计的使用 原理 光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400～750nm：小于400nm的光线称为紫外光；大于750nm的光线称为红外光。 当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过、因此光线射出溶液之后，部分光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分析。 依据Lambert-Beer（朗伯－比尔）定律，一束单色光通过溶液后，光波被吸收一部分，其吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比。 当入射光、吸收系数K和溶液的光径长度L不变时，吸光度A与溶液的浓度C成正比。 　　具体测量时， 补充知识 ７２１型可见分光光度计 紫外分光光度计 微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 原理 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。 以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH + 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O? +NH3 1 2NH3 + H2SO4 NH4 2SO4 2 NH4 2SO4 + 2NaOH 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 3 ?反应（1）、 2 在凯氏瓶内完成， 反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。 器材 1. 100ml凯氏烧瓶 2. 改进型凯氏定氮仪 3. 50ml容量瓶 4. 分析天平（电子天平）　　 5. 烘箱 6. 电炉 7. 酒精灯 8. 小玻璃珠 9. 滴定管 10. 洗瓶 11. 锥形瓶 12.铁架台 试剂 1. 消化液：30% H2O2∶浓H2SO4∶H2O 3∶2∶1 2. 30% NaOH溶液 3. 2% H3BO3溶液 4. 混合催化剂（粉末K2SO4- CuSO4混合物）K2SO4与CuSO4以3∶1比例充分研细混匀。 5. 0.01mol/L标准盐酸溶液 6. 混合指示剂（田氏指氏剂）取0.1%甲烯蓝-无水乙醇溶液50ml、0.1%甲基红-无水乙醇溶液200ml，混合，贮于棕色瓶中备用。该指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范围很窄（pH5.2～5.6）且很灵敏。 7. 蒸馏水 若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则样品中蛋白质含量（%） 总氮量×6.25 若样品中除有蛋白质外，尚含有其他含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。 蛋白氮 总氮 - 非蛋白氮 蛋白质含量（g %） 蛋白氮 × 6.25 双缩脲法 N 端 C 端 双缩脲 加热 ＋　NH3 2 2 H－ 1800 双缩脲 2 2 2 2 2 双缩脲反应:碱性环境 H2O O C C O HN NH R-CH CH-R O C Cu C O HN NH R-CH CH-R H2O 紫色络合物 原 理 双缩脲法是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法。因蛋白质含有两个以上的肽键，所以有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。 在一定的实验条件下，未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540~560nm测定，即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。 试剂 一 试剂 1．标准酪蛋白溶液（5mg/ml） 用0.05mol/L NaOH溶液配制：5g酪蛋白加0.05mol/L NaOH溶液至1 000ml。 2．双缩脲试剂 溶解1.5g硫酸铜（CuSO4 · 5H2O）和6.0 g酒石酸钾钠（NaKC4H4O6 · 4H2O）于500ml蒸馏水中。在搅拌下加入10% NaOH溶液300ml，用蒸馏水稀释到1升，贮存在内壁涂有石蜡的瓶中，可长期保存。 3．未知蛋白质溶液 γ–球蛋白溶液。 Folin－酚试剂法（Lowry法） 蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还