淀粉酶的麸曲固态发酵生产资料.docVIP

实验二 淀粉酶的麸曲固态发酵生产 孟坤鹏 学号：20121341031054 2012级 生物技术专业 三班1组 摘要：目的：运用麸曲固态发酵方法生产淀粉酶。步骤：孢子悬液的制备，将孢子悬液浓度控制在107个/ml左右，然后在麸曲固态培养基上进行培养，待其颜色由白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色，背面无色时，表明发酵完成。用蒸馏水将酶与培养基一起溶解离心取上清后及得到酶粗品，运用硫酸铵盐析法进行酶的提纯，最后进行酶活力的测定。 关键词 固态发酵 淀粉酶 硫酸铵盐析法 引言 米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶等。在淀粉酶的作用下将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子唐磊，如麦芽糖、葡萄糖等。真菌因其独特的生长、繁殖特点对生长条件的适应性已成为非常优异的农业加工副产物（麸皮）的降解菌和酶制剂生产菌。 淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉酶属于水解酶类，是催化淀粉、糖原、糊精中糖苷键水解的一类酶的统称。此类酶广泛存在于动植物和微生物中。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。 固态发酵法是微生物在没有或基本没有游离水的固态基质上的发酵方式方法，固态基质中气、液、固三相并存，即多孔性的固态基质中含有水和水不溶性物质。硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质，高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。本实验以麸皮为主要的发酵基质，豆粉饼为氮源，将米曲霉接种于富含淀粉的培养基中诱导发酵产生淀粉酶。其中，氮源是合成淀粉酶的原料，而淀粉可以诱导产量的增加，利用盐析沉淀法对粗酶进行分离纯化。 酶活力测定：淀粉在淀粉酶的随机作用下可以被分解为葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，淀粉酶催化产生的还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。 1实验内容 1.1实验材料与试剂 菌种：米曲霉（实验室提供） 试剂：（1）75％乙醇 （2）1L PBS缓冲液配方：pH7.4； 磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g； 磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g； 氯化钠(NaCl)：8g； 氯化钾(KCl)0.2g； 加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L。 （3） ① 1%淀粉溶液（称取1克可溶性淀粉，溶于100ml pH5.5柠檬酸缓冲液）； ② pH5.6的柠檬缓冲液： A液（称取柠檬酸20.01克，溶解后定容至1L） B液（称取柠檬酸钠29.41克，溶解后定容至1L） 取A液5.5ml、B液14.5ml混匀即为pH5.5柠檬酸缓冲液； ③ 3，5-二硝基水杨酸溶液（称取3，5-二硝基水杨酸1.00克，溶于20ml 1mol/L氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钠，待溶解后，用蒸馏 水稀释至100ml，盖紧瓶盖保存）； ④ 麦芽糖标准液（称取2克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，小心移入100ml容量瓶中定容）； ⑤磷酸盐缓冲液（PH6.8）取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液250 ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118 ml，用水稀释至1000 ml摇匀，即得。 配制方法： 依次称取配方的无机药品，并依次溶解混合，再加入豆粉饼，最后加入麸皮搅拌均匀。 分装到8个培养基中，压实按匀。分装完成后完成后，高压灭菌锅121℃ 灭菌20min。 （三）接种 每个培养基接1ml（具体量按计数结果来，大概每个培养基接107个）孢子悬液，并用涂布棒涂布均匀。（无菌操作） 培养 放在恒温培养箱中30℃恒温培养72h（具体时间根据米曲霉的生长状态。最佳形态 1.3.3酶的提取分离和纯化 1、粗酶液的提取[4] 在发酵结束后，在培养基加蒸馏水100ml，捣碎并搅拌均匀，40℃水浴浸提1h，用无菌纱布过滤（或抽滤），然后在5000r/min条件下离心20min,取上清液作为粗酶液。 2、淀粉酶的初步分离纯化（盐析沉淀法） 硫酸铵盐析 1）发酵液上清装至1支烧杯中。? 2）加硫酸铵至烧杯中，对照25℃硫酸铵饱和度配置表，使其饱和度60%。在加硫酸铵时需缓慢的加入，同时不断的轻柔搅拌（否则局部浓度过高会使酶失活）使硫酸铵完全溶解；?? 3）室温静置2h，出现白色沉淀? ?4）离心，得到沉淀，再用PBS缓冲液冲洗2次，并离心，得到较纯的酶。 （