miRNA定量方法.docVIP

miRNA定量PCR 1 miRNA 茎环反转录合成cDNA （1）反转录引物设计：对成熟miRNA采用茎环反转录合成cDNA，在成熟miRNA的3’端使用一条50nt 可自行折叠成茎环结构的特异性RT 引物，序列如下：5`-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACNNNNNN-3`，3’端的6个N代表与成熟 miRNA 3’端反相互补的6个碱基。 （2）反应体系：在0.2mlPCR反应管中加入μL：5× First Strand synthesis Buffer 4μL dNTP Mix 1μL RNase Inhibitor（40 units/μl） Reverse Transcriptase（M-MLV） Stem-loop RT Primer 1μL Total RNA （500 ng） RNase-free ddH2O 补至20 μL Total volume 20 μL （3）反应条件： Stage 1：Stage 2：cDNA产物的引物由一条特异性引物和一条通用引物组成，特异性引物基础序列于目标miRNA成熟序列互补，根据对引物的长度，Tm 值及GC含量的要求再用软件进行调整，可在 5’端加2-3个GC以增加退火温度，平衡GC含量，U6被作为内参序列。所有使用的引物序列被列在表3-1。 （2）应用SYBR染料法，对miRNA采用实时定量检测。反应体系参照SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）说明书，（反应液配制均在冰上进行）。 总反应体系为25μL： SYBR? Premix Ex TaqTM 12.5μL Specific Forward primer （10μM） Universal Reverse primer （10μM） cDNA 1st Strand 2μL ddH2O 8.5μL Total volume 25μL （3）Real Time PCR 反应程序Stage 1：预变性95；Stage 2：4095℃5s，60℃30s 以上循环结束后进行65℃~95℃的融解曲线分析。为确保实验数据的有效性，每个样品平行三次，溶解曲线为单一峰。按照相对定量法目的基因的相对表达量计算公Rel.?Exp 2-ΔΔCt，其中ΔΔCt 样品ΔCtCalibratorqΔCt ，理样品ΔCt 内参基因Ct目的基因CtCalibratorΔCt 参比样内参基因Ct– 参比样目的基因Ct,]。 表3-1 miRNA stem-loop qRT PCR定量引物 Table 3-1 Primers used in stem-loop qR-PCR Names Primer Sequence Tm Length GC （%） cam_miR159 RT primer 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACTAGAGC-3 Forward primer 5’-GCG CGT TTG GAT TGA AGG GA-3 60.5 20 55 cam_miR160 RT primer 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACTGGCA-3 Forward primer 5’-GCTGCCTGGCTCCCTGT-3 59.8 17 71 cam_miR164 RT primer 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACTGCACG-3 Forward primer 5’-GTCGTGGAGAAGCAGGGCA-3 61.6 19 63 cam_miR166 RT primer 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACGGGGAA-3 Forward primer 5’-GCG TCG GAC CAG GCT TCA-3 60.8 18 67 cam_miR171 RT primer 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACGATATT-3 Forward primer 5’-GCG TGA TTG AGC CGT GCC-3 60.8 18 67 cam_miR319 RT primer 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACAGGGAG-3 Forward primer 5’-GCG CTT GGA CTG AAG GGA G-3 61.6 19 63 cam_miR390