细胞冻存解冻方法与细胞计数.docVIP

细胞冻存、解冻方法与细胞计数 一、细胞冷冻保存 1.材料： 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO Sigma D-2650 、无菌塑料冷冻保存管 Nalgene　5000-0020 、0.4％（w/v）trypan blue GibcoBRL15250-061 、血球计数盘与盖玻片、等速降温机 KRYO10SeriesII 2、冷冻保存方法： （1）传统方法: 冷存管置于4℃10分钟--- -20℃30分钟--- -80℃16～18小时 或隔夜 --- 液氮槽vaporphase长期储存。 -20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 （2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 3、步骤： （1）冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。 （2）配制冷冻保存溶液 使用前配制 ：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。 （3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液 约0.1ml 计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）取与细胞悬液等量的冻存液