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3、利用大肠杆菌的表达系统 应用最广泛和成功率最高的外源基因表达宿主。 3.1、表达载体 载体有克隆载体和表达载体 3.1.1 表达载体必须具备以下特点： 1、能独立复制 (松弛型)。 2、具有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记便于外源基因的克隆、鉴定和筛选。而且克隆位点位于启动子序列之后，以使外源基因表达。 3、应具有很强的启动子，能被大肠杆菌的RNA酶识别。 4、应具有使启动子受到抑制的阻遏子，只有在受到诱导时才能进行转录。阻遏子的阻遏作用可以由物理、化学（如IPTG异丙基-?-D-硫代半乳糖苷、IAA）因素进行调节，这样可人为地选择启动子启动转录mRNA的时机。 因外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响。例如可先使宿主细胞快速生长增殖到相当量，再通过瞬时消除阻遏，使表达的蛋白质在短时间内大量积累，同时也减少表达产物的降解。 5、应具有很强的终止子， 以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其它无关的基因。同时强终止子所产生的mRNA较为稳定。诱导表达时，由于强启动子所致的高水平转录反过来会影响质粒DNA自身的复制，从而引起质粒的不稳定或脱质粒现象。因此在外源基因的下游安置强终止子可以克服由质粒转录引起的质粒不稳定。 6、所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号 即起始密码AUG和SD序列. SD序列是mRNA上的AUG起始附近的碱基, 与核糖体RNA上的序列互补, 以利于密码子的识别. 3.1.2 影响目的基因在大肠杆菌表达的因素 外源基因的表达产量与细胞浓度和每个细胞平均表达产量是正相关的。 要想获得最高产量，必须了解影响这两者的各种因素。如外源基因的拷贝数、基因的表达效率、表达产物的稳定性，细胞的代谢负荷 1）、外源基因的拷贝数 一般来说细胞内基因拷贝数增加，基因表达产物的产量也会增加。克隆在高拷贝数表达载体上的外源基因，会因表达载体拷贝数的增加而增加，因此使用高拷贝数表达载体。 2)外源基因的表达效率 A、启动子是一种能被依赖于DNA的RNA多聚酶所识别的碱基顺序，它既是RNA多聚酶的结合部位，也是转录的起始点。是在转录水平上影响基因的表达。 转录的最大频率取决于启动子的碱基组成，往往因一个碱基的不同，启动子效率可能提高上千倍。启动子有强弱之分。 真核基因启动子不能被大肠杆菌RNA酶识别，因此必须将真核基因编码区连接在大肠杆菌RNA聚合酶能识别的强启动子控制下。常用的强启动子有LAC 、TRP、TAC、 BLA等。 如果启动子太强，RNA酶有时超过了终止信号，引起过度转录和杂蛋白的生成，对宿主细胞的正常生长和基因工程产物纯化不利。同时影响载体的稳定性。所以一般在多克隆位点的下游要插入一段转录终止子。 B、 SD序列和起始密码子之间的距离及序列对mRNA翻译成蛋白质的效率有明显影响。 C、密码子组成是影响翻译的另一重要因素。这主要是因为真核基因和原核基因对编码同一氨基酸所偏爱性使用的密码子不尽相同的缘故，或可能是与不同的宿主系统中不同种类的tRNA浓度有关。应选择大肠杆菌偏爱的密码子。 3）表达产物的稳定性 真核基因在原核细胞中表达时，可以产生融合型和非融合型表达蛋白， 非融合蛋白质是不与细菌的任何蛋白和多肽融合在一起的表达蛋白，这类蛋白质具有近似于真核蛋白的结构，生物学功能也更接近于生物体内天然蛋白质的性质。但当非融合蛋白表达时，细胞内降解该蛋白质的酶由于应急反应，其活性增加，降解目标蛋白。所以即使原始表达量很高，也会被产生的蛋白酶降解。而实际产量仍然不高。 可以采用一些方法来提高表达产物在细菌体内的稳定性。 如将外源基因构建在融合蛋白表达载体中，产生融合蛋白。 也可以选用定点突变的方法改变真核蛋白二硫键的位置，来增加蛋白的稳定性。 此外选用大肠杆菌蛋白酶缺陷型作为宿主菌，有可能减弱表达产物的降解。 4）细胞的代谢负荷 大量的外源基因表达产物可能打破宿主细胞的正常生长代谢平衡，如大量的氨基酸被用于合成与细胞生长无关的蛋白质，就会影响细胞的正常代谢过程。有的表达产物对宿主细胞有害，其大量积累可能导致细胞生长缓慢甚至死亡。 减轻宿主细胞代谢负荷的措施是将宿主细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段， 首先使宿主细胞的生物量达到饱和，在这一阶段中采用一定的方法抑制重组质粒的复制或不诱导基因产物的合成，以减少宿主细胞的代谢负荷； 在第二阶段再诱导细胞重组质粒的复制或诱导基因产物表达。 3.1.3在大肠杆菌中真核基因的表达形式 融合蛋白 非融合蛋白 分泌型表达蛋白 融合蛋白是指蛋白质的N段是一段原核DNA编码的序列，C端接上真核基因编码的序列。 表达融合蛋白的优