第3章细胞分离技术教案.ppt

2、小分子添加剂 小分子添加剂可降低蛋白的聚集，可提高复性得率。 3、模拟体内蛋白折叠过程 细胞内，内源肽链的折叠和聚集受分子伴侣和折叠酶的调节。 因此，共表达分子伴侣和折叠酶可提高外源蛋白的可溶性。 4.辅助折叠方式 利用复性液中的去污剂捕获变性蛋白，形成复合物，抑制蛋白聚集，然后加入环糊精从复合体中除去去污剂，使蛋白逐渐复性。 5、温和溶解工艺相结合提高复性率 调节pH值远离蛋白质的等电点，使蛋白在低浓渡变性剂中溶解而不聚集。 氨基酸序列再折叠及纯化过程将变得简单。 * 肽聚糖：含量高，占壁重的30~70% ；不同菌种中肽聚糖(肽链)组分不同,具重要分类意义 ◆??革兰氏阳性细菌肽聚糖（peptidoglycan）的结构 （幻灯片015.016.017.018）以Staphylococcus aureus为代表。肽聚糖层厚度为20~80nm，由约40层网状分子组成。网状的肽聚糖大分子是由大量小分子单体聚合而成的。每一肽聚糖单体含有三个组成部分：a)??? 双糖单位，N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸分子通过B-1，4-糖苷键连接而成；b)??? 短肽尾，由四个氨基酸连起来的短肽连接在N-乙酰胞壁酸分子上。这四个氨基酸是L-丙氨酸-D-谷氨酸-L-赖氨酸-D-丙氨酸；c)??? 肽桥，S. Aureus的肽桥为甘氨酸五肽。肽桥的氨基端与前一肽聚糖链中一个肽尾的第四氨基酸——D-丙氨酸的羧基相连接，而它的羧基端则与相邻的肽聚糖链中一个肽尾的第三氨基酸——碱性氨基酸L-赖氨酸的氨基相连接，从而使前后两个肽聚糖链交联起来。溶菌酶：A. Fleming，1922年发现，存在于卵清、人的泪液和鼻涕、部分细菌和噬菌体内，能有效地水解细菌肽聚糖，作用于肽聚糖骨架上的N-乙酰胞壁酸的C1与N-乙酰葡糖胺C4之间的B-1，4-糖苷键。 Gram positive cells have only two layers, the cytoplasmic membrane and a THICK LAYER of peptidoglycan as the outermost component. * 幻灯片023）以E. Coli为代表，肽聚糖含量 不足细胞壁的10%，一般由1~2层网状分子构成，在细胞壁上的厚度仅为~3nm。结构单体与革兰氏阳性细菌基本相同，差别仅在于：a)?? 肽尾的第三个氨基酸为内消旋二氨基庚二酸（m-DAP）；b)?? 没有特殊的肽桥，其前后两条肽聚糖链之间的联系仅由甲肽尾第四氨基酸——D-丙氨酸的羧基与乙肽尾第三氨基酸——m-二氨基庚二酸的氨基直接连接而成。幻灯片023.022 示革兰氏阳性细菌与阴性细菌肽聚糖网的结构和致密度的差别。 外壁蛋白—为特异性载体,可将Vit B12这类较大分子送入细胞内。 基质蛋白——埋嵌在外壁层中,如孔蛋白,三聚体构成的疏水孔道贯穿外壁层,使小于800-900D的分子可通过,起分子筛作用。 脂蛋白—与肽聚糖层共价结合,并埋置在外壁层,使外壁层牢固的与内壁层连接。 革兰氏阴性细菌的外壁层中有许多镶嵌蛋白质，主要有：a)?? 基质蛋白（mattix protein），如E. Coli中的孔蛋白（porin）就是一种研究较多的基质蛋白。孔蛋白是一种三聚体结构，每一个亚单位的分子量为36,000。由三聚体结构构成的充水孔道横跨外壁层，可通过分子量小于800~900的亲水性营养物质，例如糖类（尤其是双糖）、氨基酸、二肽、三肽、青霉素和无机离子等。它使外壁层具有分子筛的功能；b)?? 外壁蛋白（outer membrane protein），是一种特异性的运送蛋白或受体，可把较大的分子如维生素B12、麦芽寡糖、核酸降解物以及铁离子螯合剂——铁色素（ferrichrome）或肠螯合素（enterochelin）等送入细胞内；c)?? 脂蛋白（lipoprotein），种类很多，主要是分子量为7200的脂蛋白，其作用是使细胞壁的外壁层牢固地连接在由肽聚糖组成的内壁层上。 In #GRAM NEGATIVE cells the cell wall consists of three components; the cytoplasmic membrane, a thin layer of a rigid sugar MOLECULE NET immediately exterior to the cytoplasmic membrane that covers the entire cytoplasmic membrane and an outermost lipid bilayer called the OUTER MEMBR