Rheb基因克隆总结.docVIP

绒山羊成纤维细胞Rheb基因克隆 1、引物设计 以Ovis aries Ras homolog enriched in brain (RHEB)为参考序列设计引物如下： P1: ATGCCGCAGTCCAAGTCC P2 :TCACATCACCGAGCAGGAAG 2、 RT-PCR扩增 1）反应体系（10μl）： TaKaLA Taq(5U/μl) 0.1μl 10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Plus) 1μl P1(10μM) 1μl P2(10μM) 1μl Template cDNA 1μl dNTP(2.5mM each) 1.6μl d3H2O 4.3μl 2）循环体系： 94℃ 4min；（94℃ 30sec，63℃ 30sec，72℃ 40sec）×32；72℃ 10min。 3）PCR扩增电泳图 1 2 3 4 5 1：DL2000 ，2：Rheb PCR 产物，3：引物二聚体，4：β-actin,5: DL2000 3表达模式 反应体系（10μl）： TaKaLA Taq(5U/μl) 0.1μl 10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Plus) 1μl P1(10μM) 1μl P2(10μM) 0.2、0.4、0.4、0.5、0.5、0.5、0.5μl cDNA 1μl dNTP(2.5mM each) 1.6μl d3H2O 5.1、4.9、4.9、4.8、4.8、4.8、4.8μl 2）循环体系： 94℃ 4min；（94℃ 30sec，63℃ 30sec，72℃ 40sec）×30；72℃ 10min。 3) 表达模式图 睾丸 脑 肝 肺 乳腺 脾 肾 从图中可以看出，Rheb在睾丸中的表达量最多，在脑和肝中的表达量最少，在乳腺、脾、肾中的表达量相对较多，而在肺中的量居中。 4 重组质粒鉴定 酶切反应体系 双酶切体系： d3H2O 11uL 10×H缓冲液 2uL 精提质粒 5uL EcoR I 1uL Pst I 1Ul 单酶切体系： d3H2O 12uL 10×K缓冲液 2uL 精提质粒 5uL BamH I 1uL 2) 重组质粒鉴定图谱 1 2 3 4 1:DL2000，2:双酶切产物，3:单酶切产物，4:λ-EcoT14 . 4)序列 ATGCCGCAGTCCAAGTCCCGGAAGATCGCGATCCTGGGCTACCGGTCTGTGGGGAAATCCTCGTTGACGATTCAGTTTGTTGAAGGCCAACTTGTTGACTCCTACGATCCAACCATAGAAAATACTTTCACAAAATTGATCACAGTAAATGGACAGGAGTATCATCTTCAGCTTGTGGACACAGCTGGGCAGGATGAATATTCCATCTTTCCTCAGACATACTCCATAGATATTAATGGTTATATTCTTGTGTATTCTGTTACATCAATCAAAAGTTTTGAAGTGATCAAAGTTATCCATGGCAAATTATTGGATATGGTGGGGAAAGTACAAGTACCTATTATGTTGGTTGGGAATAAGAAAGACCTACATATGGAAAGGGTGATCAGTTATGAAGGAGGGAAAGCGTTAGCAGAGTCTTGGAACGCAGCGTTTTTGGAATCATCTGC