04-2014级硕士高级免疫学实验技术-ELISA详解.ppt

高级免疫学实验技术 2014级硕士研究生 吉林大学基础医学院 免疫学系 酶联免疫吸附试验 Enzyme linked immuno-sorbent Assay, ELISA 间接法-测抗OVA抗体的效价 实验原理 实验分组、试剂与器材 试剂： 封闭液 1%PBS-脱脂奶粉 7ml 洗液 PBS-Tween20 1瓶 抗OVA抗体 ml 酶标抗体 HRP-GaM 5ml 底物 5ml 终止液 H2SO4 2.5ml 器材： 酶标板 1块 200?l pipette 1把 1000 ?l pipette 1把 Tip 大/小 若干 1.5ml EP管 若干 培养箱43℃ 1个 吸水纸 若干 四人一组，每人做一排 注意事项 清点好实验物品 加样器的正确使用 加样器头不能混用，尤其是吸酶和底物 底物应现用现配 包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原 OVA，10?g/ml 稀释。 100 ?l/well加入聚苯乙烯酶标板中，4℃ over night。 封闭：次日，弃去孔内溶液。加入150 ?l/well 　1%PBS-脱脂奶粉 封闭液 , 43℃ for 60mins。 加样：弃去封闭液，加倍比稀释的抗OVA抗体100 ?l/孔， 43℃孵育40mins 。孵育结束后，用PBS-T洗三次，每次5min 。 酶抗：酶标抗体 HRP-羊抗鼠IgG ，100?l/well ，置43℃孵育40mins，用PBS-T洗三次，每次5min 。 显色：于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100?l/well，室温下避光显色。 终止：加50 ?l/well　2M硫酸 终止液 。 altering the pH 判定： 肉眼观察：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的抗体的稀释度倒数为该抗体的效价。酶标仪测量： 490nm滤光片下测光吸收值 A ，与阴性对照相比其A值≥2，相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。 包被（coating 固相支持物： 聚苯乙烯和聚氯乙烯－有较强的非特异性物理吸附蛋白质的特性，被吸附的蛋白质的免疫学活性不发生改变（Ag-Ab结合）。 包被缓冲液： 碳酸盐缓冲液（pH＝9.6） 磷酸盐缓冲液（pH＝7.2） Tris-HCL缓冲液（pH＝7-8） 包被温度、时间： 4℃ 　18-24小时 包被抗原量： 10?g/ml 包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原 OVA，10?g/ml 稀释。 100 ?l/well加入聚苯乙烯酶标板中，4℃ over night。 封闭：次日，弃去孔内溶液。加入150 ?l/well 1% PBS-脱脂奶粉 封闭液 , 43℃ for 60mins。 加样：弃去封闭液，加倍比稀释的抗OVA抗体100 ?l/孔。 43℃　孵育40mins。 孵育结束后，用PBS-T洗三次，每次5min 。 酶抗：酶标抗体 HRP-羊抗鼠IgG ，100?l/well ，置43℃孵育40mins，用PBS-T洗三次，每次5min 。 显色：于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100?l/well，室温下避光显色。 终止：加50 ?l/well　2M硫酸 终止液 。 altering the pH 判定：肉眼观察：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的抗体的稀释度倒数为该抗体的效价。酶标仪测量：490nm滤光片下测光吸收值 A ，与阴性对照相比其A值≥2，相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。 封闭 blocking 高浓度的无关蛋白质 包被时所用的抗原或抗体浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。见图： E E E E E E Coating Blocking After blocking After blocking Without blocking Effect of Blocking 最常用的封闭剂： 0.5%-1%的牛血清白蛋白（BSA） 10%的小牛血清 1%明胶 洗液（磷酸盐缓冲液，PBS-T）　 磷酸盐缓冲液：（PBS） 吐温20（Tween 20 : 抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂 抑制非特异性吸附 包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原 OVA，10?g/ml 稀释。100 ?l/well加入聚苯乙烯酶标板中，4℃ over night。 封闭：次日，弃去孔内溶液。加入150 ?l/well 　1% PBS-脱脂奶粉 封闭液）, 43℃ for 60min。 加样： 弃去封闭液，加倍比稀释的抗OVA抗体100 ?l/孔，（稀释与加板方法）。 43℃