双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用中的应用教程范本.docVIP

双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用 摘 要 双分子荧光互补技术是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术。该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段，这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用，彼此靠近，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，从而产生荧光。BiFC方法简单直观，具有可视性的特点，对温度敏感，荧光片段种类较多，被广泛地应用到不同的细胞中，既可以检测蛋白之间的相互作用，也可以定位蛋白质相互作用的位点。此外，BiFC还能在蛋白构型的确定以及的检测方面发挥作用。经过若干年的发展，双色荧光互补技术已经发展成包括多色荧光互补技术，BiFC和FET联用技术以及BiFC和YTH联用技术在内的多种技术，拓宽了BiFC的应用。 关键词双分子荧光互补技术蛋白质片段互补 荧光蛋白 蛋白质相互作用 蛋白质之间的相互作用(Protein-protein interactions，PPIs)形成了细胞中的调节网络，用来调控细胞的许多功能。因此，研究蛋白之间的相互作用对于深入了解许多生命过程具有非常重要的意义。迄今为止，已经建立了多种技术和方法用于研究蛋白与蛋白之间的相互作用，如酵母双杂交技术(Yeast two-hybridYTH)，荧光共振能量迁移(Fluorescence resonance energy transferFRET)和蛋白片段互补技术(Protein fragment complementationsPFCs)等方法(表1)。在蛋白片段互补技术中，双分子荧光互补技术(Bimolecular fluorescence complementationBiFC)由于观察直观，检测方便以及能实现在活细胞中对相互作用蛋白可视化等诸多优点，自从其被开发出来后，便得到了广泛地应用。 1 双分子荧光互补技术的提出及理论依据 BiFC技术本质上是一种蛋白质片段互补技术，是指将荧光蛋白多肽链在某些不保守的氨基酸处切开，形成不发荧光的N-和C-末端2个多肽片段。将这2个荧光蛋白片段分别连接到1对能发生相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这2个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，从而产生荧光1](图1)。目前用于BiFC技术的荧光蛋白包括GFP(Green fluorescent protein，绿色荧光蛋白)，YFP(Yellow fluorescent protein，黄色荧光蛋白)，CFP(Cyan fluorescent protein，青色荧光蛋白)，BFP(Blue fluorescent protein，蓝色荧光蛋白)和FP(Red fluorescent protein，红色荧光蛋白)等。 最先将荧光蛋白用于蛋白互补实验的是Ghosh等人[2]。2002年Hu等人在此基础上首次提出了BiFC这个概念。他们将1个GFP的突变子增强型黄色荧光蛋白(EYFP)从不同位点切开，用1组相互作用的同向平行的亮氨酸拉链(多肽bFos和bJun)融合到切开的YFP蛋白的N片段和C片段，分别在大肠杆菌中共表达不同组合的融合多肽。他们发现，当EYFP从氨基酸Ala154-Asp155间切时所构建的1组融合多肽，能够在细菌细胞中产生YFP的荧光。他们将这个技术称之为BiFC，并对BiFC的相关性质以及影响因素进行了详细的讨论。这篇文章的发表标志着BiFC作为一种可视化观察蛋白质相互作用的技术被正式建立起来[3]。自此，不同的荧光蛋白突变体被运用到BiFC系统中用来提高荧光强度、增加荧光颜色或减少背景荧光等(表2)。 从BiFC的原理可以看出，构成BiFC技术的三大理论依据分别是蛋白质剪接(Protein splicing)机制的发现，蛋白质片段互补技术(Protein fragment complementation)的提出以及绿色荧光蛋白结构与功能的解析。 2 双分子荧光互补技术(BiFC)的特点 2.1 可视化 可视化是BiFC技术最大的特点。在此技术中，荧光蛋白由于相互靠近而重新构成能发出荧光的蛋白，这种荧光是自我催化的结果，不需要底物与辅助因子，非常稳定，而且通过荧光显微镜和流式细胞仪等常规仪器很容易检测到BiFC信号，这种直观性使得BiFC技术在短短几年迅速获得应用，已经成为检测活体细胞中蛋白质相互作用的一种常规方法。这种可视性既可以直观地观察到蛋白的相互作用，而且还能通过对这种可视化的荧光进行定量从而确定蛋白相互作用的强弱，极大地方便了蛋白相互作用之间的研究。2002年Hu等[3]首次在动物活细胞中运用GFP及其突变体研究蛋白与蛋白间的相互作用。他们鉴定了7个BiFC复合体(BN173