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实验四?? 聚合酶链反应（PCR） [实验原理] ????聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术是美国Cetus公司人类遗传研究所的科学家K.B.Mullis于1983年发明的一种体外扩增特定基因或DNA序列的方法。PCR具有很高的特异性、灵敏度，在分子生物学、基因工程研究、某些疾病的诊断以及临床标本中病原体检测等方面具有极为重要的应用价值。 ????双链DNA分子在接近沸点的温度下解链，形成两条单链DNA分子（变性），与待扩增片段两端互补的寡核苷酸（引物）分别与两条单链DNA分子两侧的序列特异性结合（退火、复性），在适宜的条件下，DNA聚合聚利用反应混合物中的4种脱氧核苷酸（dNTP），在引物的引导下，按5’3’的方向合成互补链，即引物的延伸。这种热变性、复性、延伸的过程就是一个PCR循环。随着循环的进行，前一个循环的产物又可以作为下一个循环的模板，使产物的数量按2n方式增长。从理论上讲，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。 ????除上述典型的PCR反应外，人们还根据各种用途设计了各种不同类型的特殊PCR。如利用反转录PCR（RT-PCR），即利用组织mRNA进行反转录后合成第一链cDNA，以此为模板经PCR合成特定目的基因；反向PCR，常规PCR允许扩增两条引物之间的DNA片段，而反向PCR则可以对靶DNA区域之外的两侧未知的DNA序列进行扩增；不对称PCR使用的引物浓度不同，两种引物浓度相差100倍，在最初的20个循环中主要产物是双链DNA，当低浓度引物被消耗后，高浓度引物引导的PCR反应产生大量单链DNA分子，可用于DNA的序列测定；在PCR-ELISA中，将引物用地高辛、生物素或放射性同位素标记，再进行PCR扩增，用ELISA方法检测反应产物的灵敏度可提高百倍以上；采用定量PCR，即用荧光物质标记引物，根据反应进程中荧光变化情况，可以确定组织中mRNA含量，从而了解不同生长发育时期组织特定基因的表达水平等。 ????影响PCR反应结果的因素较多，主要包括 （1）模板的质量：在制备模板DNA时通常需要使用蛋白变性剂及乙醇等有机溶剂，这些物质可直接影响PCR反应；另外当模板DNA分子量很高时，解链不易，可用限制酶消化以改善扩增效果；从理论上说，一个模板DNA分子即可获得扩增产物，模板浓度过高，PCR反应的特异性下降，实际操作中可按1ng、0.1ng、0.01ng递减的方式设置模板浓度对照。 （2）引物：引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则： ①引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。 ②引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。 ③人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。 ④引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用0.25-0.5pmoL/μL较好。 （3）Mg2+浓度：PCR反应体系中Mg2+浓度对扩增结果影响较大，通常是1.5-4mmoL/L，必要时可调整Mg2+浓度。 （4）dNTP浓度：1.25mmol/L，dNTP浓度过高，反应的特异性下降。 （5）反应条件：PCR反应条件中最重要的是退火温度，退火温度低，引物容易结合到模板的靶DNA序列，但反应的特异性下降；反之，特异性增加，但扩增效果不佳。一些生物技术公司在合成引物时注明了Tm值，以此为依据，退火温度比Tm值低3-5℃比较适宜。当然，在实际操作时可设置梯度以确定最佳退火温度。 ?[实验目的] ????了解聚合酶链反应（PCR）的基本原理及其影响因素，掌握PCR的基本操作过程。 [仪器] ????PCR仪、台式离心机、电泳仪、电泳槽、紫外检测仪 [试剂] 1．??? 10 μmol /μL。 2．??? Taq 3．??? 10×PCR 4．??? dNTPs10mM 5．??? R基因片段的重组cDNA的质粒 6．??? 1% 7．??? 50 ×TAE(1000 mL) ????Tri