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实验十六 RT-PCR PCR 技术的原理与应用 一、PCR技术的基本原理 1.原理 2.反应三步曲 3.反应五要素 4.反应的具体过程 二、PCR技术的特点 三、PCR技术的主要用途 四、几种重要的PCR衍生技术 * 实验原理 RT-PCR=RT+PCR RT （reverse transcription）： 逆转录合成cDNA PCR （polymerase chain reaction）： 聚合酶链反应，合成大量DNA 是一种分析基因表达的快速灵敏的方法。 逆转录酶 A AA A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 以mRNA为模板，经逆转录合成与mRNA碱基序列互补的DNA链。此法称为cDNA法。 Polymerase Chain Reaction 聚合酶链反应 简称PCR 一、PCR技术的基本原理 1.原理 模拟细胞内DNA的复制过程，在体外进行特定DNA片段的高效扩增。 胞内DNA复制： 起始 延伸 终止 2.反应三步曲 一、PCR技术的基本原理 变性：约94℃，30s 退火：45 ℃ ~55 ℃， 30s 延伸：72 ℃， 依扩增片段长度决定时间 以上三步为一个循环，约25个循环后，可获得大量目的DNA分子。 扩增倍数为(1+x)n, x=75%, n为循环数。 3.反应五要素 模板 引物 聚合酶（耐热的Taq DNA聚合酶） dNTP 缓冲液及Mg2+ 一、PCR技术的基本原理 The Nobel Prize in Chemistry 1993 for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry Michael Smith 1944 - 1932 - 2000 La Jolla, CA, USA Kary B. Mullis University of British Columbia Vancouver, Canada for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies 一、PCR技术的基本原理 4.反应的具体过程 操作步骤—RT反应（每小组做1份） 试剂 加入量 ②溶液B (dNTPs) 1μl ③溶液D（5 ×RT buffer) 4μl ④溶液E（酶混合液） 1μl ⑤ 总RNA 1μl ⑥溶液 G 12μl ①溶液A（随机引物） 1μl 总体积 20ul 缓慢混匀上述体系，用掌型离心机离心约10s将样品收集至管底，按下列条件进行反转录反应： 42℃保温60min，95℃保温5min，4℃保温5min，然后-20 ℃长期保存。 操作步骤—PCR反应（每小组做1份） 试剂 加入量 最终含量 ②溶液F (10×PCR buffer) 5μl ③溶液B(dNTPs) 1μl ④引物