doi10.6043j.issn.0438-0479.201607004.docVIP

doi:10.6043/j.issn.0438-0479.201607004 ELISA双抗夹心法检测临床鼻咽抽吸物中呼吸道合胞病毒 孙永鹏1，靳输梅1，詹炉停1，温桂平1,2，赵敏1,2，张伟1,2，夏宁邵1,2，郑子峥1 * (1. 厦门大学分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室， 2. 厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，福建 厦门361102) 摘要：呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）是引起5岁以下儿童因下呼吸道感染而住院的主要病原体。目前常用的试剂盒是美国Diagnostic Hybrids公司研发的七项呼吸道病毒检测试剂盒，但其价格昂贵，且需荧光显微镜辅助诊断，不利于在基层医疗机构中推广，国内尚无上市的快速诊断试剂用于临床检测。本研究建立用于RSV抗原检测的早期快速诊断试剂。以RT-PCR(反转录聚合酶链反应)检测为金标准，同时使用ELISA双抗夹心法和免疫荧光法对112份临床NPA样本进行检测，以RT-PCR为参比，ELISA双抗夹心法和免疫荧光法的灵敏度分别为79.31%、74.14%；特异性分别为100%、96.30%；Kappa值分别为0.78、0.69，两者都表现了与RT-PCR检测法高度一致性。此外ELISA双抗夹心法和免疫荧光法两种检测方法χ2=0.26，二者差异无统计学意义（p＞0.05）。ELISA双抗夹心法操作简便，特异性高，有望代替进口检测试剂盒完成RSV感染的早期快速诊断。 关键词：呼吸道合胞病毒（RSV）；融合蛋白（F蛋白）；双抗夹心法 ；酶联免疫吸附分析（ELISA）；快速诊断 中图分类号：R373.9 文献标志码：A呼吸道合胞病毒（espiratory syncytial virus，RSV）是全世界范围内引起婴幼儿急性下呼吸道感染的主要病原体之一[1]，其发病率高，流行面广[2]。几乎所有的2周岁儿童都曾感染过RSV，约36%的婴幼儿在2周岁内出现反复感染现象[3]。此外，RSV同样易感于老人[4]和免疫功能不全者[5]。RSV主要损伤细支气管上皮细胞[6]，临床表现为中等度发热，咳痰，呼吸困难、喘息，甚至窒息等[7]，与其他引起下呼吸道感染的病原体所引起的症状相似，无法根据临床症状和体征确诊RSV感染。因此，发展RSV早期诊断试剂有利于RSV的快速确诊和及时治疗，避免滥用抗生素，减少医疗支出。RSV抗原检测主要依靠诊断试剂确证，目前主流的检测方法是检测病毒、病毒的表面蛋白以及核酸的存在来确定RSV的感染。LISA）及核酸扩增技术（PCR）等。病毒分离法存在检测周期长，灵敏度低，人工成本较高等问题[8]；PCR技术灵敏度高，特异性强，但对操作者要求较高，并且存在易被污染的问题[9]；免疫荧光法检测试剂主要依靠进口，检测仪器（荧光显微镜）价格昂贵，不适用于中小医院，且检测结果易受主观判断的影响[10]。血清学诊断主要对RSV既往感染进行检测，无法进行疾病早期诊断[11]。 本研究利用筛选到的抗RSV F蛋白的单克隆抗体，建立了基于酶联免疫吸附（ELISA）双抗体夹心法的RSV抗原检测方法，并以RT-PCR检测作为金标准，免疫荧光法双抗夹心检测方法进行了评价。 1 材料与方法 材料 Hep-2细胞（美国NIH疫苗研究中心馈赠）；RSV A2毒株（美国NIH疫苗研究中心馈赠）；BALB／c小鼠，雌性，6~8周龄（上海斯莱克实验动物有限公司）；七项呼吸道病毒检测试剂盒(美国Diagnostic Hybrids公司)；含F蛋白全长基因的质粒（VRC8400-full length F，美国NIH疫苗中心馈赠）；含F蛋白单体基因的质粒（VRC8400-monomer F，美国NIH疫苗中心馈赠）；弗氏佐剂、 辣根过氧化物酶（HRP）干粉（Sigma公司）；MEM培养基干粉、1640培养基干粉、胎牛血清等细胞培养相关试剂（Gibco公司）；帕利珠单克隆抗体（商品名：Synagis，美国NIH疫苗研究中心馈赠）；融合后F蛋白（post-F，美国NIH疫苗中心馈赠）；鼻咽抽吸物（NPA，重庆儿童医院和厦门市检验检疫局）；5种裂解液：5%(v/v)Tween-20（BBI公司）、1%(m/v)CHAPS（Miragen公司）、1%(v/v)Triton X-100（AMRESCO公司）、0.5%(m/v)SB3-14Sigma公司、0.5%(m/v)DTABSigma公司。 病毒培养方法 Hep-2 细胞生长至密度约90%；弃细胞培养上清，每个10 cm细胞培养板内留约 12 mL 的培养基；从-80 ℃取出病毒菌种，37℃水浴中快速化冻；向每个10 cm细胞培养板中板加入200 μL病毒，晃动细胞培养板使病毒液体与细胞充分接