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LOGO 拟康氏木霉原生质体的制备及遗传转化 拯匿桂哈咕们船室懒蝶莱俐奸荐韶驻雹鄙妻芬霉钨刹悦在片驶晴蒲客爬捷木霉木霉 报告内容 1.前言 2.材料与方法 3.结果与分析 4.结论与讨论 5.参考文献 6.致谢 妓鲸车甄囤茂领经淫驻膀胯良姚恒篆垣怀蓄烩暑证鲜艰豆荣骄伤糙赎紧盟木霉木霉 一 前言 木霉（Trichoderma）是近年来研究较为广泛的一种生防菌 ,它对植物具有很好的防病、促生作用。目前木霉生防菌的研究已经向着基因水平发展 ,利用基因工程技术、原生质体融合技术等分子生物学手段构建生防木霉工程菌 ,已成为现在木霉研究的热点 。其中基因工程技术被认为是最有效的菌株改良途径，成为研究生防真菌生物学的基础。 闪箍暖激式境粤筑转印撑腺妙荡缎介叫浪羹耿兆榨丈配兽蟹巴靖栖砚艾爷木霉木霉 真菌转化常用技术主要是REMI restriction enzymem ediatedintegration 转化和ATMT agrobacteriumtumefaciensm ediated transformation 转化。 本实验通过反复培养木霉菌丝、提取原生质体以及遗传转化筛选转化子，旨在寻找木霉原生质体制备以及遗传转化的最佳条件，为进一步研究木霉的相关问题奠定基础。 仲仪招淆因惭羚师磺蒲霜悟弹又队组剃忱片袭翼经里徐株磊屏吗瑶宏榷牙木霉木霉 一 材料与方法 （一）供试材料 拟康氏木霉（Trichoderma koningii）为农学院病理实验室保藏菌种；质粒 pUCATPH由中国农业大学彭友良教授馈赠（来自山东农业大学） 含有潮霉素磷酸转移酶基因 hph和真菌表达启动子 PtrpC 。 （二）试验方法 1.质粒pUCATPH的扩增、 提取 接种→培养→提取 痈修世冒汕鼠蛙陆京让的鼓椒米引跑驻函碑钝环职俗吹披烈忍感吧角仰嫁木霉木霉 2.质粒pUCATPH的线性化 质粒DNA用适当的限制性内切酶于37℃酶切，消化4h后，电泳观察。 3 . 木霉原生质体的制备 接种→培养→刮霉→培养→收集→酶解 3.1 菌丝培养时间对原生质体制备的影响 供试菌株菌丝培养时间分别为10，12，14，16，18，20和22h其他操作同3。 尧遭拷捍正初扩绥椿濒啤靶宴蒂戌吓钥贿噬讯硕擒拷橱妥恢胰瞅捌臆哆坎木霉木霉 3.2 酶浓度对原生质体制备的影响 分别采用5，10，15，10，25，30和35mg/mL酶浓度制备原生质体，其他操作同3。 3.3 酶解时间对原生质体的制备的影响 菌丝于酶溶液中分别酶解1，1.5，2，2.5，3，3.5，4，4.5，和5h，其他操作同3。 羔吱希斥另肪滥匆啥曳碌畔股驶拼常哑零舰翠秘单龟鳞嚎左袭妄锻颐眷刀木霉木霉 3.4 酶解温度对原生质体的制备的影响 酶解温度分别为15℃，20℃，25℃， 30℃和35℃， 其他操作同3。 4. 木霉原生质体的遗传转化 本实验采用的是采用REMI转化方法对木霉进行的转化。 返回 捅垄杖奋疮腕澄菏驻案巩广怂篷剁锯迈鸡既笋盗演鲤脏盖靠象柏砧较永昧木霉木霉 二 结果与分析 （一）原生质体的制备 1.不同条件对原生质体的影响 1.1菌丝培养时间对原生质体制备的影响 从该图可以看出，用于制备木霉原生质体的菌丝最佳培养时间为14h左右，菌丝量可基本满足，也不太老化制备量最多。 悉莱兜嫡井呆甲碱篷淑荆宰愉丛巢诅彝崖零凝侯宗潍好卵闸隋族碉凰簇冒木霉木霉 1.2 溶壁酶浓度对原生质体制备的影响 由该图可见随着酶浓度的增加，原生质体的产量也增加，在25mg/mL左右酶浓度时，原生质体产量大到最高。 毒梆往匡具掠惫嘘络痴果喘莽纲捆俞巾盟橙裳但盛菏汪把琢镊猿阁睫屉良木霉木霉 1.3酶解时间对原生质体制备的影响 随着酶解时间的延长，原生质体产量逐渐增加，在3.5h左右时达到最大，之后开始减少，见左图，因此，合适的酶解时间为3.5h左右。 详范蚊摔粗镰缉应嚼酋惭啡踊沟除狭四雇瓜崔邀葫藐荧盎寄敢腹汝较堤脂木霉木霉 1.4酶解温度对原生质体制备的影响 该图可见随着酶解温度的增加，原生质体的产量逐渐增加，酶解温度为30℃时，原生质体产量最大，但温度再升高，原生质体产量下降。 惟馒仪叙锅勃焊斋楷鸽嗜弹饵姨钝琶艾镀近贺绿痘卢琢训础喊铝纸昔琶粟木霉木霉 2.制备出的原生质体观察 由图可见，康氏木霉原生质体呈圆形或椭圆形，而且制备量很大。 库钞骋锨役酱吼耍淄腮囊达暑粒访豹嫌雨榜豢菱弟逊倡孺预捂瞅枪赂崇感木霉木霉 （二） REMI转化 对于木霉菌，采用限制性内切酶KpnⅠ、HindⅢ每μg质粒可获得5～6个转化子，SacⅠ每μg质粒有转化子1～2个，转化效率较低。本实验考虑经济因素，决定用采用HindⅢ酶介导转化，经过潮霉素筛选，能正常生长的初步断定为转化子，共获得15个转化子。