GABA和GAD、DAO活性测定2010-1-4.docVIP

GABA含量、GAD及DAO酶活力测定方法 一、样品的前处理方法 称取豆芽1 g左右（干豆粉0.5克，识情况取量）→加入7%乙酸1 ml于研钵中（石英砂）→研成匀浆→转移到10 ml离心管中→再用7 %乙酸提取液洗涤研钵2次，每次2 ml，洗涤液亦转入离心管（共5ml的HAC洗研钵中的残留样品，注意不要倒到管壁上）→提取1 h（间或摇晃）→4000 rpm的转速离心10 min→取上清液＋5 ml无水乙醇（沉淀多糖，4℃，至少2小时，可在冰箱中醇沉过夜）→4000 rpm离心20 min（视情况，使上清液清晰）→上清液转移至50 ml烧杯内→于90℃水浴中蒸干（40min）→用500 μl的蒸馏水充分溶解残渣并全部转移入1ml离心管 3000 rpm离心10 min→ 二、点样 采用国产新华层析3号滤纸20×24 cm，干法点样10 μl 标样浓度 5m mol/L的GABA Glu为2m mol/L (对照)，点样端在正极 电泳： 电解液为：16ml吡啶+16ml冰乙酸 (通风橱中配)，加蒸馏水定溶至1000ml容量瓶中（也可对半配）(吡啶：冰乙酸：蒸馏水=16﹕16﹕968) 电泳条件：U=300 v，I=180~200Ma，P=55~60W，t=1.5h（视情况调整） 电泳纸点样端放到电泳槽正极端，电泳液浸透电泳纸且两端都浸在电泳液中，电泳完毕后，取出电泳纸于鼓风干燥箱内烘干，挥尽残留吡啶和冰醋酸，在90℃条件下烘30min，氨基酸即显出紫红色斑点。 显色：显色剂（0.5%）： 0.2克茚三酮+40ml无水乙醇，滴管浸透，倒置烘干显色。 洗脱：洗脱液 1%硫酸铜：75%乙醇=2：38 (1%硫酸铜25ml：75%乙醇475 ml即得500ml洗脱液) 1%硫酸铜 1克硫酸铜+100ml水 75%乙醇 375ml无水乙醇定溶至500ml 将相应GABA和Glu的色斑剪下置于具塞试管中，加入4ml洗脱剂（1% CuSO4·5H2O﹕75%乙醇=2﹕38），32℃恒温振荡器内洗脱完全(电泳纸无色) 比色：水作对照，515 nm比色测定吸光值A。 外标法计算： 洗脱液配置：1% CuSO4 25ml + 75%乙醇 475ml （量少对半配置或相应减倍） 高效液相色谱法测定GABA: 1样品处理 称取豆芽1 g左右（干豆粉0.5克，识情况取量）→加入7%乙酸1 ml于研钵中（石英砂）→研成匀浆→转移到10 ml离心管中→再用7 %乙酸提取液洗涤研钵2次，每次2 ml，洗涤液亦转入离心管（共5ml的HAC洗研钵中的残留样品，注意不要倒到管壁上）→提取1 h（间或摇晃）→4000 rpm的转速离心10 min→取上清液＋5 ml无水乙醇（沉淀多糖，4℃，至少2小时，可在冰箱中醇沉过夜）→4000 rpm离心20 min（视情况，使上清液清晰）→上清液转移至50 ml烧杯内→于90℃水浴中蒸干（40min）。溶于1 mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液 (pH 9.0)中，取适量样品溶液与等体积的氨基酸衍生剂（4 mg/ml的4-二甲氨基偶氮苯磺酰氯丙酮溶液）混合，于67 °C水浴中反应10 min后立即置于冰浴中终止反应，反应液于6000 g离心20 min，上清液经0.45 μm 2色谱条件 色谱柱：采用Agilent SB-C18柱（4.6×250 mm, 5 μm）；流动相：流动相A为0.045 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.0），流动相B为乙腈；柱温30 °C；检测波长425 nm；流速1 ml/min；进样量20 μl。洗脱程序见表5-1。 表6-1 洗脱顺序表 Table 6-1 Elution program 时间/min 流动相A (%) 流动相B (%) 0 70 30 10 70 30 12 62 38 20 62 38 22 55 45 30 55 45 36 40 60 40 40 60 41 30 70 50 30 70 GAD活性测定： Determination of GAD Activity The reaction mixture consisted of 10 mL of 80 mM sodium phosphate, pH 5.6, 100 mM L-glutamate, 0.2 mM PLP, and 1 g plant tissues. Incubated at 40 oC for 60 min, and then terminated by water bath at 90 oC for 5 min. After centrifugation (3000 rpm, 10 min), the GABA in the supernat