单克隆抗体技术(终)分解.ppt

单克隆抗体技术 张阳 组员：周人杰 耿玥 王慧 赵军 聂守一 张阳 提纲 单克隆抗体的概念 单克隆抗体的制备 单克隆抗体的应用 莱克多巴胺单克隆抗体 1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合，成功建立了单克隆抗体技术，而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。 每个B淋巴细胞仅专一地产生、分泌一种针对某种抗原决定簇的特异性抗体，而肿瘤细胞可以无限增殖，因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内条件下分泌大量单克隆抗体。 单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗原分子大量制备纯一的单克隆抗体。 一、单克隆抗体的概念（monoclonal antibody, McAb） 概念：通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆产生的具有均一性抗体的技术。 细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞集团。 B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。 杂交瘤技术 通过融合经过免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主要技术途径。 二、单克隆抗体的制备 （一）制备原理： 用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT-）或胸腺嘧啶核苷酸酶（TK-）的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。采用HAT选择性培养基对融合细胞进行培养和筛选。 HAT选择性培养基： 培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T。 单克隆抗体制备原理 HAT培养基的选择原理： （1）氨基蝶呤(A)是叶酸拮抗剂，可阻断细胞利用正常途径合成DNA，细胞在含有氨甲蝶呤的培养基中不能通过正常途径合成DNA。 （2）瘤细胞是HGPRT酶阴性细胞，自身不能通过替代途径合成DNA而繁殖。 （3）B细胞虽含有HGPRT，但不能在体外培养存活（只存活5~7d，且功能下降)。 （4）融合细胞含有B细胞和瘤细胞，其中瘤细胞核利用B细胞的HGPRT酶进行旁路合成DNA而存活。 单克隆抗体的制备原理 经HAT选择后的各种细胞的结果 融合的B细胞和瘤细胞; 由于杂交细胞获得了： （1）HGPRT、 TK 酶基因并正常表达、利用培养基中的H、T 合成DNA （2）瘤细胞的“永生性”而得以存活和无限扩增。 未融合的B细胞、融合的B细胞和B细胞以及B细胞的多聚体; 因不能正常合成DNA而死亡 未融合的瘤细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、以及瘤细胞的多聚体等; 因不能正常合成DNA而死亡。 （二）基本制备流程 （三）单克隆抗体的制备步骤 1、免疫原的制备 2、免疫动物 3、骨髓瘤细胞的准备 4、细胞融合 5、杂交瘤细胞及阳性孔的筛选 6、阳性孔的特异性检测及特异性阳性孔的克隆 7、单克隆抗体的制取 1、免疫原的制备 颗粒性抗原：病毒、细菌、真菌等微生物和蛋白等分子量大于5000Da生物物质。 可溶性抗原：多糖、药物、激素、肽类等分子量小于 5000 Da 物质。 注意：可溶性抗原需与BSA、OA等载体交联后成颗粒性抗原才能刺激动物产生可应用的高效价的抗体。 2、免疫动物 （1）动物选择：一般采用与骨髓瘤细胞供体来源同一品系的动物进行免疫（如：小鼠）。由于免疫动物品系与所采用的骨髓瘤细胞差异较远，产生的杂交瘤细胞稳定性越差。 （2）抗原与载体：抗原分为可溶性和颗粒性抗原，载体分膜体和珠体。 （3）免疫途径：较为常用 的途径有腹腔，皮下淋巴器官或静脉等，较为常用的途径是腹腔注射。 2、免疫动物 可溶性抗原（蛋白质）： 以1mg/ml～5mg／ml的溶液加等量的弗氏完全佐剂