基因克隆与表达解析.pptVIP

蛋白原核表达 卫文强 2015.12 目的基因-T 表达载体 酶切， 胶回收，连接 转化到克隆用细胞（Top10) 提质粒，酶切验证 转化到表达用细胞（BL21（DE3)） 诱导表达 SDS用时在冰上操作； 取酶用干燥、灭菌、新的枪头 酶用量不能超过酶切总体积的10%； 多种酶进行酶切时，先低盐后高盐缓冲液； ? ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，连接缓冲液宜分装； ?单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； ? PEG：5%以下可以提高连接效率 BL21 :lon, ompT BL21(DE3) : T7 polymerase Rosetta: optimal codons Origami : thioredoxin reductase (trxB) , glutathione reductase (gor) Rosetta-gami Origami B: (IPTG concentration dependent) 基本原理 SDS技术是根据SDS能使蛋白质变性解聚成肽链并与肽链侧链以一定比例结合成SDS—肽链复合体，从而掩盖了肽链本身所带电荷（SDS带负电），并消除了蛋白质分子间的形状差异，再结合PAGE技术（根据分子的形状、电荷、分子量综合差异来分离不同分子的技术）来分离不同分子量蛋白质或测定定蛋白质分子量的实验技术。 基本步骤 制备分离胶 制备浓缩胶 上样并电泳 凝胶板剥离与染色脱色 结果分析 凝胶板剥离与染色 电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1-2小时左右。 脱色：染色后的凝胶用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质条带清晰。 结果分析 标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。 加入分离胶溶液 pH 8.8 封水 出现明显界面时，分离胶凝聚完成（ ３０min~１h） 倒出水，并用滤纸吸干 制备分离胶 封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 分离胶 pH 8.8 加入浓缩胶溶液 pH 6.8 制备浓缩胶 样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。 插入样品梳 加入电极缓冲液pH 8.3 浓缩胶 pH 6.8 通电 分离胶 pH 8.8 加入样品 上样及电泳 开始电压恒定在80V，当进入分离胶后改为120V，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。 * * * * DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。 1）. DNA的纯度 ?影响限制性内切酶活性的因素 2）. DNA的甲基化程度 dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。 3）. 温度 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。 是影响限制酶活性的重要因素。 4）. 缓冲液(Buffer) 商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。 MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定； β－巯基乙醇：保持酶的稳定性，防止酶失活。 关心小贴士告诉你 ? 使用时注意事项： 连接、转化与重组子鉴定 1、连接 （1）必须是两条双链DNA。 （2）DNA 3’ 端有游离的-OH， 5’端有一个磷酸基团（P）。 （3）需要能量 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+ （2）. 连接条件 ?连接效果最好在37 ℃，但形成的互补不稳定; ?最佳连接温度：12-16 ℃，较好的连接效果，互补又较稳定; 2）连接温度： 3）反应液中的成分： ?目的或作用： 4）插入片段与载体的浓度比例 ?载体DNA与外源DNA的分子摩尔比通常为1﹕3左右