重组白细胞介素2(03版课件.pptVIP

注射用重组人白细胞介素-2 学号：座机电话号码 姓名：单海丽 班级：09级生物工程（4）班 * * 简介 白细胞介素-2（ IL－2）是由Morgan和 Ruscetti发现的 由T细胞产生的一种淋巴因子，是一个分子质量为14500 的糖蛋白。可使细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞 N K 和淋 巴因子激活的杀伤细胞 LAK 增殖，并升高其杀伤活性， 进而清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。还可促进干扰 素、肿瘤坏死因子等细胞因子的分泌和抗体产生，是一种 免疫增强剂，具有抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫功能等 作用。 * * 免疫作用机理： IL -2 能与任何能形成IL -2 受体的细胞, 如辅助 性T 细胞 T H 、细胞毒性T 细胞 T e 、B 细胞和自 然杀伤细胞结合, 但结合的强度以T c 细胞为最高。 IL -2 与相应受体结合后, 细胞即从G 相进入S 相 并开始分化增殖。 * * 临床应用： 1. 肿瘤治疗： 在恶性肿瘤的发病机制中, 肿瘤病人的白介素-2 含量 较正常的水平低, 不能使NK、CT L、LAK 等杀伤细胞活化 和增殖, 使肿瘤细胞逃逸，得不到清除。此时必须提供外源 白介素-2, 帮助病人完成免疫监视功能, 这就是白介素-2 治疗 肿瘤的免疫学基础。 * * 2.抗病毒感染 3.对感染性疾病的治疗作用 4.对其他疾病的治疗：白介素-2 在急性白血病、抗高 血压、抗寄生虫、免疫佐剂等方面都有着积极的应用。 * * IL-2 一 级 结 构 * * 结构改造 IL-2为螺旋状的长肽链，由133个氨基酸组成，其中 共有三个半胱氨酸（cys 分别在第58、105、125位，其中 58位与105位的cys生成的二硫键为活性所必需，且易错配 或生成二聚体，降低生物活性。基因工程重组IL-2用点突 变的方法把125位的cys改成Ser或Ala，使IL-2分子稳定性增 强。如果用点突变的方法把58或105位的cys变成其他氨基 酸，则rIL-2的活性几乎完全丧失。 * * 改造后的优点 1.提高白细胞介素2的比活性 2.提高白细胞介素2的稳定性： 由于野生型白细胞介素2分子中125位cyt是游离的，易 于与58或105位的cyt形成错配的二硫键，或分子间形成二 硫键而导致二聚体的形成，不利于白细胞介素2的稳定。 125位丝氨酸型白细胞介素2则不存在二硫键错配问题。 * * 3.易于纯化： 在重组白细胞介素2的纯化过程中，白细胞介素2要被还原 剂还原为一级结构，然后再氧化为有活性的白细胞介素2 。由 于125位cyt是游离的，易于与58或105位的cyt形成错配的二硫 键，或分子间形成二硫键而导致二聚体的形成。这些形成的异 构体和二聚体一方面会给纯化工作带来麻烦，另一方面比活性 降低。125位cyt被ser或Ala取代的IL-2则不纯在错配问题，因而 有利于IL-2的纯化。 4.降低毒性： 125位cyt被ser或Ala取代的IL-2由于比活性进一步提高，在 给予同等活性的IL-2时，新型IL-2由于蛋白质的绝对数量较少而 可能具有较小的毒性，更容易被病人耐受，从而有利于临床治 疗的进行。 * * 化学修饰： 对蛋白进行化学修饰后可以提高其抗酶消化的能力, 延 长其在体内的作用时间, 提高药效，降低或消除其在体内 的免疫原性。对IL-2 进行修饰的主要为PEG,。 1992 年有人利用N-羟基丁二酰胺活化PEG 修饰r IL-2, 作用时间提高10 倍，而且免疫原性下降, 抗肿瘤性能提高, 毒副作用有所降低。 1994 年和1997 年及其后都有人用PEG 修饰rIL-2 得到 生物活性基本不变而抗原性降低的修饰蛋白的报道; 随后白 介素-2 的化学修饰研究与其它蛋白的化学修饰一样成为了 研究的热点。 * * 基因重组制备流程 IL-2 cDNA 文库的构建 利用探针杂交筛选 IL-2 cDNA阳性克隆 与质粒载体pBV220连接，并转入大肠杆菌DH5a IL-2基因表达 分离纯化包涵体 溶解，复性，纯化 纯化的rIL-2 T细胞mRNA 反转录 cDNA * * 一种制备方法： 1.构建工程菌：将载有IL-2基因的质粒导入大肠杆菌细胞中，筛选出目的菌。 2.挑单菌落接种于装有LB培养基的摇瓶中，在30 ℃振荡培养8-10小时，然后转入含有合成培养基的发酵罐中，30 ℃下培养11-13小时，再在42 ℃下培养5-6小时，发酵后收集菌体。 3.包涵体提取：取菌体，用PH8.5，浓度为50mMol Tris.Hcl-1mMol EDTA-1mMol DTT缓冲液洗两遍，沉淀物再悬于同样缓冲液中，加溶菌酶，4 ℃下作用30分钟，冰浴超声至完全破裂为止，离心除去可溶性杂志，沉淀悬于PH8.5浓度为5