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第八章 植物基因工程 转基因植物 将外源基因导入植物细胞，经组织培养，获得能够表达外源基因的植物称为转基因植物。 抗虫 抗病 抗逆 生产药物 第一节 植物的转基因技术 植物细胞培养技术 植物转基因技术的基本路线 转基因的受体系统 外源基因导入植物的方法 一、植物转基因技术的基本路线 分离目的基因 将目的基因与载体连接，形成重组DNA 利用细菌繁殖扩增重组DNA 将与表达载体相连的重组DNA导入到目标植物的细胞中 筛选转化细胞，并诱导产生转基因植株 转基因植株大规模种植 三、外源基因导入植物的方法 （一）DNA直接转移法 化学刺激法 PEG、PNA（肽核酸）、磷酸钙、氯化钙 电击法 基因枪法 花粉通道法 将外源DNA片段在自花授粉后的特定时期注入柱头或花柱，外源DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化不具备细胞壁的受精卵，合子或早期胚体细胞。 （二）载体介导法 Ti 质粒介导的整合转化程序 植物病毒介导的转染程序（略） 1 Ti 质粒介导的整合转化程序 Ti 质粒的结构与功能 双子叶植物尤其豆科植物的根部常常会由于植物根部被土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）形成根瘤，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti质粒（Tumor-inducing plasmid）介导的，又称肿瘤诱导质粒。 （1） Ti 质粒的图谱区 整个质粒160 -240 kb T-DNA区、 Vir区、 Con区、 Ori区 （6）Ti 质粒的改造 除去T-DNA上的tmt，tms和tmr生物合成基因； 除去 Ti 质粒的其它非必需序列， 安装大肠杆菌复制子， 安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列； 插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆。 ①pGV3850 特点：外源基因不能直接插入，需要借助于pBR322质粒作为中间载体 选择标记 脓杆菌选择标记 宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。卡那霉素抗性（ Kanr ）基因（卡那霉素对植物有剧毒！） 最终受体植物的选择标记 位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因（nos）。 共 整 合 转 化 程 序 ②双元载体（binary vectors） 能在大肠杆菌和农杆菌中复制，是穿梭载体。 双元载体的结构 Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。 大幅度减小质粒的体积。（10kb） 双元载体的转化 基因插入 转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。 帮助质粒（ helper plasmid） 受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提供vir产物。 双元系统是穿梭质粒和Ti质粒两个质粒 ，在接合后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。 穿梭质粒编码植物选择标记、表达信号、多克隆位点、两个T-DNA 双元系统中的 Ti 具有Vir基因和农杆菌复制起始子(OriA)，但没有T-DNA边界序列。 接合后，两个质粒可以自主共存于同一农杆菌细胞中。 穿梭质粒可在农杆菌内自主复制 插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。 第三节 植物转基因技术在植物品种改良中的应用 控制果实成熟的转基因植物 抗病虫害的转基因植物 抗除草剂的转基因植物 改变花卉形状和颜色的转基因植物 抗环境压力的转基因植物 产高品质产物的转基因植物 七、转基因生物潜在危害 转基因植物引发的安全事件 英国Pusztai事件 康奈尔大学斑蝶事件 加拿大“超级杂草”事件 墨西哥玉米事件 中国Bt抗虫棉事件 潜在危害 转基因食品可能具有毒性 ; 转基因食品可能产生过敏反应; 抗生素标记基因可能使人和动物产生抗药性 ; 病毒重组,发生基因重组,产生新的病毒,产生变异,或产生新病毒 转基因作物的生态安全性问题转 基作物本身可能演变为农田杂草 对生态环境的影响：植物的“转基因逃逸” 种苗的散失/残缺组织的再生 花粉的传播 “转基因逃逸”造成的危害： 诱发害虫和野草的抗性问题 诱发基因转移跨越物种屏障 诱发自然生物种群的改变 基因污染 食物链的破坏 转基因育种的程序 基因分离 体外重组 转化 转化体 安全性评价 结合常规育种 转基因品种 遗传稳定性评价 市场开发 载体的构建 农杆菌介导 基因枪轰击 筛选 * * * * ①转移DNA T-DNA（transfer-DNA） 左边界 右边界 生长素 基因 细胞分