微生物学期末描述.doc

第一章 微生物工程菌种 四．菌种选育：应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然)造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程。菌种选育的目的是为了不断提高发酵工业产品的产量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。菌种选育的方向是选育“吃粗粮”、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株 1、自然选育：某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味着这种突变是没有原因的。自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱变效应（由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应）和互变异构效应（自然突变两种情况：菌种的衰退和生产质量下降生产性能提高） A、自然选育的一般程序：制备单孢子（单细胞）悬液、适当稀释、在固体平板上分离、、挑取部分单菌落进行生产能力测定、经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株 B、自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高 2、诱变育种：人为地利用物理或化学等因素，使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法 A、诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺 B、诱变育种的一般步骤：原始菌株（出发菌株）、细胞或孢子悬液制备、诱变剂处理、中间培养、突变株分离、初筛、复筛、生产性能试验 （1）出发菌株的选择：选择对诱变剂敏感性强、变异幅度大的菌株作为出发菌株；最好选用已经过生产选育的自发突变菌株；采用具有有利性状的菌株作为亲本，如生长速度快，营养要求低等；由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱变因素的敏感性提高，故有时可考虑选择已发生其它变异的菌株作为出发菌株 （2）单细胞（或单孢子）悬液制备：采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液进行诱变处理（原因：分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂、可避免长出不纯的菌落。） 处理前，细胞应尽可能达到同步生长状态，细胞菌龄一般在对数期。霉菌的菌丝一般是多核的，所以对霉菌的处理一般应采用孢子悬浮液。若在处理前细胞进行前培养，则变异率可大大提高 （3）诱变剂及使用剂量的选择 a.诱变剂：凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素 物理诱变剂：紫外线、X-射线、(-射线、快中子、超声波等 化学诱变剂：硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝酸(NA)、氮芥(NM)、羟胺、ICR类等 紫外线：使用历史较久、廉价、危险性小、效果好，应用较广。作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性,造成菌体变异甚至死亡 亚硝酸：常用的有效诱变剂，其诱变作用主要是脱去碱基中的氨基 b.确定诱变剂后，诱变剂剂量的选择也是育种工作的一个关键问题。 对一般微生物而言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降。在使用高剂量诱变时，除个别核被诱发变异外，还可以使其它的核破坏致死，最终能形成较纯的变异菌落；另外，高剂量可能引起遗传物质的巨大损伤，产生回复突变少，促使变异后菌株的稳定（凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适剂量） c.处理方法： 单一诱变剂处理 复合处理：1）两种或多种诱变剂先后使用；2）同一诱变剂重复处；3）两种或多种诱变剂同时使用 （4）诱变处理后的后培养 表型迟延现象：生理性、分离性 遗传物质经诱变处理后发生的突变，必须经复制才能表现出来；诱变后的一小时内必须进行新的蛋白质合成，这个变异才有效；必须在完全培养基中进行培养才能稳定变异，使菌株表现出高的突变频率。 （5）变异菌株的筛选 a.初筛：迅速地从大量菌株中挑选出较好的一些菌，着眼于尽量扩大挑选范围。一般采用观察初筛菌落在平板上的生理效应所呈现的变色圈、透明圈、生长圈或抑菌圈的大小来进行初步测定。 b.复筛：选出产量最高的1-2个菌株，主要着眼于在接近生产条件的情况下精确地测定出菌株的生产性状。将初筛所得到的菌株接种到三角瓶中做摇瓶培养，然后对其培养液进行定量分析测试 3几种重要突变株 a经诱变后，菌种的性能有可能发生各种各样的变异，这些变异均可用各种方法筛选出来. （1）、营养缺陷型菌株的筛选：育种标记、影印培养法、夹层培养法、逐个检出