新手都会听到别人说RNase很顽固,用高压灭菌都无法去除.docVIP

刚涉及RNA抽提的新手都会听到别人说RNase很顽固，用高压灭菌都无法去除其活性。于是在配制tris缓冲液时就遇到了两难的境地。tris缓冲液不能用DEPC处理，只能用DEPC处理过的水配制，那么在药品称量、调pH值等过程中tris缓冲液会造到RNase的再次污染，所以是一个两难的境地。但是今天我要谈的是RNase并不顽固，高压灭菌可以去除其大量活性。 下面的实验照片（照片来自ambion）很清楚的显示了高压灭菌的效果。实验很简单，将不同含量的RNase用高压灭菌处理，然后与未高压灭菌处理的RNase一起来降解RNA（37度1小时），结果表明，当RNase的污染量小于100ng/ml时，高压灭菌可以去除其活性。这张照片还说明了一个问题，当你的RNA溶液中含有很微量的RNase污染时，不用过于担心，因为RNase对RNA的降解是需要时间的，更何况你的RNA是存放在低温下的。 DEPC有致癌性，不能处理Tris溶液等这些事项大家都知道，所以不谈。谈一些实验室中的操作误区。 误区一：重复使用含DEPC的水处理枪头、离心管等。由于DEPC较贵，而且书上说DEPC要用高压灭菌处理去除，于是有些人就萌发了重复使用DEPC的想法，即对含有DEPC的水不进行高压灭菌，从而重复使用含DEPC的水处理枪头、离心管等。节约本是好事，但这样的节约是无效的。为什么不能重复使用含DEPC的水，因为DEPC在水溶液中不稳定，极易分解，DEPC在pH6.0和pH7.0的PBS缓冲液中的半衰期分别约为20min和10min，DEPC在水中的半衰期约为30min。因此，重复使用含DEPC的水就不能保证枪头和离心管的RNase-free。 误区二：必需长时间高压灭菌来彻底去除DEPC。用DEPC处理过的溶液，在15－20min的高压灭菌后还可以闻到一股特殊的香味，因此有人认为高压灭菌去除DEPC不彻底，所以要延长高压灭菌的时间以完全去除DEPC。但是延长高压灭菌的时间并不需要，因为闻到的特殊香味不是DEPC的，而是DEPC分解产物之一的乙醇同溶液中残留的微量的羧酸（如甲酸和乙酸等）反应产生的挥发性脂类。这种特殊的水果香味不代表有痕量的DEPC残留。 误区三：溶液中DEPC含量约高，灭活RNase的效果越好。这个误区错了一半，的确，1% DEPC能灭活高达1000 ng/ml的RNase A，而0.1% DEPC只能灭活少于500 ng/ml的RNase A。但是溶液中残留的DEPC副产物会抑制一些酶反应，例如DEPC副产物会抑制体外转录反应，因此DEPC含量越高，高压灭菌后的DEPC副产物就越多，抑制越明显。 不少的文献都说，用LiCl 沉淀RNA有很多好处，比如只沉淀RNA，不会沉淀DNA、蛋白和多糖等。但就是操作比较麻烦，比如，过夜沉淀，不能沉淀小分子RNA等。下面就LiCl 沉淀方法的误区进行探讨。 误区一：LiCl 不能沉淀小分子RNA。很多文献都说LiCl 沉淀的RNA不含小分子的5s rRNA和tRNA。但，事实是这样吗？至少在我的实验中发现LiCl 可以沉淀小分子RNA。下面的图片更能说明LiCl 可以沉淀小分子RNA。泳道1是RNA maker，泳道2、3、4是用LiCl 沉淀的RNA。当然LiCl 沉淀tRNA的效果真的不好，其原因可能是tRNA的高度二级结构。 误区二：LiCl 沉淀需要长时间和低温。不少文献上说LiCl 沉淀需要4度、－20度、甚至－80度下放置1小时、2小时、甚至过夜，其操作极其繁杂。但是，LiCl 沉淀真的需要长时间和低温吗？让我们来看看下面的数据：Lane 1, RNA marker. Lane 2, RNA centrifutged immediately without chilling. Lane 3, RNA chilled at -20°C for 30 minutes before centrifugation. Lane 4, RNA incubated at 25°C for 30 minutes to test precipitation time independently of chilling. Lane 5, RNA chilled at -20°C for 1 hour. Lane 6, RNA incubated at 25°C for 1 hour. 图片显示放置30min后，RNA沉淀比不放置更有效（请比较泳道2和3），但是比较泳道3、4、5、6后，你会发现在－20度下沉淀与在25度下沉淀没有区别，放置30min与放置1小时沉淀没有区别。但是建议大家用 -20°C ＋ 30 minutes 的沉淀方法，因为低温能降低RNases的活性（假设有痕量的RNase残留） 小提