2015.1102修-葫蔓藤碱甲素甲的油水分配系数与稳定性精选.doc

葫蔓藤碱甲的油水分配系数与稳定性研究 摘 要：目的 测定葫蔓藤碱甲的稳定性以及油水分配系数。方法：考察葫蔓藤碱甲在-20℃和室温温度（约25℃）下及不同pH水溶液中的稳定性。采用UPLC法测定葫蔓藤碱甲在纯水中的平衡溶解度；采用摇瓶法与UPLC法结合测定葫蔓藤碱甲在不同pH缓冲液中的油水分配系数；结果：在-20℃和室温温度条件下，7天内葫蔓藤碱甲水溶液在pH=7.4稳定性良好。在pH=3.0、6.5、7.4、9.0条件下葫蔓藤碱甲的稳定性良好，而在pH=1条件下稳定性较差。在纯水中葫蔓藤碱甲48h的平衡溶解度为5.39±0.15g/L。在pH=1.0、3.0、6.5、7.4、9.0的缓冲液中葫蔓藤碱甲的表观油水分配系数log P分别为1.37±0.04、1.28±0.02、1.36±0.007、1.44±0.01、1.16±0.0005。结论：37℃条件下葫蔓藤碱甲在强酸条件下稳定性较差，在pH 3～9稳定性较好。微溶于水，酸性与碱性条件下其亲脂都较好。 关键词：葫蔓藤碱甲；稳定性； 平衡溶解度； 油水分配系数； UPLC 葫蔓藤碱甲提取于马钱科、钩吻属常绿木质藤本 图1.葫蔓藤碱甲结构式。 1 仪器与试药 1.1 仪器 超高效液相色谱仪（美国Waters ACQUITYPLC System）；BT21S型电子分析天平（瑞士METTLER-TOLEPO公司）；冷冻高速离心机（5810R德国Eppendorf公司）；MS3digital型涡旋仪（德国IKA公司）；移液枪（德国Eppendorf公司）；KH-250SP超声清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；超纯水系统（美国MiLLpore公司）；真空干燥箱（埃朗科技国际贸易上海有限公司）；冰箱（博西华家用电器有限公司）；pH计（梅特勒-托利多FE 20型）。 1.2 药品与试剂 葫蔓藤碱甲对照品、钩吻素甲对照品（成都普菲德生物技术有限公司，纯度≥98%）；甲醇、乙腈（美国默克公司，色谱纯）；双蒸水；盐酸、氢氧化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾均为分析纯。 2 葫蔓藤碱甲UPLC分析方法的建立与验证 2.1 方法建立 2.1.1 色谱条件[15-19] ：色谱柱：ACQUITY UPLC ? BEH C18 1.7um，2.1x50mm Column；柱温：30℃；检测器：二级管阵列检测器，流动相：乙腈（A）-0.05%氨水 (B)，采用梯度洗脱方法：0min～98%B，0.5min～98%B，1min～70%B，3min～70%B，3.5min～98%B，4.0min～98%B；流动相流速：0.3mL/min；检测波长：256nm；进样体积10ul。下图1分别为空白溶剂（50%甲醇溶液）、葫蔓藤碱甲溶液、葫蔓藤碱甲及内标（钩吻素甲）混合液在上述UPLC条件下进样的紫外吸收图谱。 2.1.2 标准曲线的制作 以50%甲醇配制浓度分别为1.25，2.5．5，10，20和40uM的葫蔓藤碱甲标准液，按体积比V内：V葫蔓藤碱甲=1:4的体积比加入内标后按上述UPLC色谱条件进样分析，以峰面积比值X对钩葫蔓藤碱甲浓度C进行线性回归，得到标准曲线为：y = 0.1464X-0.0367， R2 = 0.9993(见图二)，说明葫蔓藤碱甲50%甲醇溶液在1.25~40uM浓度范围内线性关系良好 2.2 方法验证 2.2.1 定量限的确定 以50%甲醇配制浓度为0.5uM的葫蔓藤碱甲标准液，其中内标为5uM钩吻素甲，按上述UPLC色谱条件连续进样6针分析，以葫蔓藤碱甲峰面积与内标峰面积的比值X代入标准曲线计算出浓度，RSD=0.78%，波动较稳定，因此0.5uM可作为定量限 2.2.2 精密度实验 配制浓度为2.5uM，10uM 和40uM的葫蔓藤碱甲的50%甲醇溶液，分别在1d内加内标测定5次，分别得日内精密度为0.4%、1.29%、3.77%，3种溶液每天加内标测定一次，连续测定3d，得日间精密度1.78%、4.60%、5.55%。说明仪器稳定。 C/μM 日内精密度% (n=5) 日间精密度%( n=3) 2.5 0.4 1.78 10 1.29 4.60 40 3.77 5.55 2.2.3 回收率实验 精密称取葫蔓藤碱甲，用50%甲醇配制成100uM的标准溶液，用50%甲醇稀释成2.5uM，10uM 和20uM的葫蔓藤碱甲50%甲醇溶液，V内：V葫蔓藤碱甲=1:4的体积比加入内标后按上述UPLC条件进样各10ul，代入标准曲线计算回收率，平均回收率分别为101.36%、104.58%、102.3%。表明该方法正常，可用于定量测定。 表2 .葫蔓藤碱甲回收率实验结果 组别 40uM