WB原理及操作注意事项汇总.pptVIP

1. 较低的信号，低灵敏度 增强信号： 优化一抗 浓缩样品 选择更高敏感度的发光底物（millipore的 比Thermo的敏感很多） 2. 整体高背景和荧光高背景 减少曝光时间 荧光高背景针对免疫荧光wb，PVDF和NC膜会造成相当高的自发荧光背景，可选用Immobilon-FL,专门针对荧光检测使用，背景比PVDF低10倍，比NC低2倍 显影液放置30sec 显影液放置1min The high af?nity of PVDF for protein gives ef?cient transfer and high detection ef?ciency, but it can make background control more dif?cult. PVDF is the membrane of choice for stripping and reprobing. WB原理及操作注意事项 印迹法(bloting)是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质印迹分析称为Western印迹法（Western bloting），对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。 原理 免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有SDS的高分辨力和固相免疫测定高特异性和敏感性，现已成为蛋白质分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对某种蛋白进行定性和半定量分析。 特点 1.SDS的高分辨力 2.固相免疫测定高特异性和敏感性 常见问题和注意事项 一.蛋白处理与样品处理 二.蛋白质转印 三.免疫杂交 四.信号检测 一、蛋白处理与样品处理 1.如何选择裂解液？ 2.目标蛋白含量低怎么办？ 1.如何选择裂解液 变性裂解液：快速，含有离子型去垢剂，作用强，可迅速从组织和细胞中提取大量蛋白质 eg：2*SDS上样缓冲液 非变性裂解液：较温和，适用于识别非变性的抗原表位的抗体，可配合免疫沉淀、活性分析等应用 eg：RIPA buffer（含TritonX-100，提全细胞蛋白） Total protein Extraction Kit (含NP-40，更温和) Whole Cell Extraction Kit(最温和，可做酶活性分析) Nuclear Extraction Kit(用来提取核蛋白) 2.目标蛋白表达量低 加大上样体积 浓缩样品 超滤离心，快速、高效，且可以起到一定的提纯效果，去除一些小分子蛋白 增大胶厚度 二、蛋白质转印 1.转印不完全 2.小分子蛋白的穿流 3.免疫检测前如何判断转移效果 4.操作规范 1.转印不完全 要选对膜！ 常用的膜有两种： PVDF：聚偏二氟乙烯 NC： 硝酸纤维素 优化转移过程 调节转移缓冲液成分： SDS（0.05%） 甲醇（10%-20%小分子除外） 延长凝胶在转移缓冲液中平衡时间（去除凝胶中的SDS） 5-30min In SDSsystems, the running buffer is supplemented with SDS. This SDS concentrates from the cathode reservoir and runs into the gel behind the bromophenol blue tracking dye. Since most gels are run until the tracking dye is at the bottom of the gel, all of the excess SDS remains in the gel and is carried over into the blotting procedure. If it isn’t allowed to diffuse out of the gel prior to transfer, it wil