石蜡切片法预案.pptVIP

用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。通常石蜡采用熔点为56～58℃或60～62℃两种，可根据季节及操作环境温度来选用。 * 通常切片厚度为4～7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。 * 用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后的脱蜡、水化及染色等步骤中二者滑脱开。粘附剂是蛋白甘油。首先在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带（连续切片）或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺正，或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥，也可在37℃温箱中干燥，但需适当延长时间。 * 在显微镜下观察植物体内部的细微结构之前，必须根据植物材料的特性，采用不同的方法，对植物材料进行处理，把材料制成透明的玻片标本。 基本原则：保持其原有的组织结构和相互关系。 切片法徒手切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、石蜡切片法、冰冻切片法等优点：组织间的各种构造能保持正常的相互关系缺点：切成薄片，不能看到完整的组织 非切片法 整体封藏法：单胞藻、鸡胚、菌类等?涂片法：花粉粒?压片法：染色体?优点：操作简单，保持每个单位（组织）完整?缺点：由于受到压迫等，组成部分的正常位置关系有所变动? ? ? ?  石蜡切片法是以石蜡作包埋剂，用旋转切片机将材料切成薄片，经一系列处理制成永久制片的方法。在研究植物的细胞、组织、胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法。 石蜡切片法的一般流程为：取材→固定→抽气→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→粘片→染色→封片。 用锋利的刀片切取新鲜的植物材料，选定适宜的材料，立即固定。 取材的注意事项如下： （1）取材料要新鲜。动作要迅速，以免挤压损坏组织；取病理材料时，应设置对照材料。 （2）所取材料大小要适当：根和茎一般直径≤5mm，切取成5-10mm小段；叶片一般取过中脉处，切成2-5mm宽、5-8mm长。在切材料时，必须注意刀片与中轴成直角，两切面平行，否则制成的切片细胞是斜的。 雌、雄蕊一般不需分割。 （3）取材时间可根据切片要求有所区别。如：在进行植物发育的研究过程时，需要找到细胞分裂相，一般在晴天的早晨9：00-10：00时取材，此时植物细胞分裂活动较明显。 （4）取材不易过老，否则制片有难度（过老的材料须在滑走切片机上进行）；对纵切的材料适当多取材，如根尖、茎尖等，因为切到材料正中的概率较低。 将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中。借助固定液的作用，使细胞的新陈代谢瞬时停止，并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化。从而达到使组织变硬从而便于切片、增强内含物的折光度、令细胞易于着色的目的，同时具有防腐作用。以新鲜配制固定液效果较好。固定的时间依材料的种类、性质、大小等而定。材料固定完毕，保存于加盖的容器内，贴上标签。 良好的固定剂，应是穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固；不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色。 简单固定液 以一种化学药品配制的固定液。 ⑴ 乙醇 为凝固型固定剂。常用无水乙醇或95％乙醇。 ⑵ 甲醛 为非凝固性固定剂。具强烈刺激性气味。纯净的甲醛为无色透明液体。固定用的浓度为4%-10％。 ⑶ 醋酸 为凝固型固定剂。为无色透明的液体，刺激性极强，低温下凝结成冰，故又名冰醋酸。 由几种试剂，适量配制而成。混合遵循原则：① 优缺点互补；② 膨胀与收缩相互平衡；③ 强氧化剂与还原剂应分别配置。 ⑴ FAA 固定液（福尔马林－冰醋酸－乙醇） 广泛适用于根、茎、叶、花药、子房的组织切片，所以又称为万能固定液。一般固定时间不低于24 h。该固定液优点是在较低温度下（10℃左右）适用于材料的长期保存，可兼作保存液。并且固定的材料，不妨碍染色，但用于细胞学上的固定效果较差。 ⑵ 纳瓦兴(Navaschjns)固定液 1912年首创。适用于细胞学与组织学研究的切片观察。但渗透慢，不能长期保存；主要用于显示分裂相。 植物材料内部多由于含有空气，导致固定液不能完全深入。材料投入固定液后需要立即抽气。以便