实验7植物总DNA的提取及含量、纯度测定预案.pptVIP

实验7 植物总DNA的提取 五、思考题 为了保证植物DNA的完整性，在分离提取过程中应注意那些问题？ * * 一、实验目的 学习提取和纯化高等植物总DNA的方法，理解其原理。 脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA) 与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。 植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。 二、实验原理 ①机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； ②化学试剂法：用SDS或CTAB等试剂处理细胞； ③酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。 细胞破碎 CTAB法：阳离子去污剂十六烷三甲基溴化铵（CTAB）可以溶解细胞膜与脂膜，并能与核酸形成复合物，通过离心就可将复合物与蛋白以及多糖类物质分开。最后通过异丙醇或乙醇沉淀DNA，使之形成纤维状絮团，CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去，离心沉淀收集得到DNA。 DNA提取 蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA 常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，或选取幼嫩的材料。 DNA纯化（去杂质） 1．取三支干净的离心管，其中一支加入10ml CTAB，于60 ℃水浴中预热； 2．取 1.0 g 植物叶片，撕碎或剪碎后置于预冷的研钵中，加液氮后迅速研磨； 3．将叶片粉（不用称重）转入预热CTAB的离心管中，混匀，于60 ℃水浴中保温30min，期间颠倒混匀2－3次；2-3步破碎细胞 4. 加入等体积氯仿:异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒混匀2min或者80次（注意：有机溶剂遇热易挥发，有机蒸汽对离心管盖子有压力），室温4000r/min离心8min，上清转入另一支干净离心管中；有机溶剂抽提去蛋白 5．在上清中加入2/3体积预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，可见 DNA 絮状沉淀；沉淀DNA并除去CTAB 6．弃去上清，保留沉淀，加入20ml洗涤液轻轻颠倒清洗5min，倒掉上清液，将离心管倒置，室温干燥至离心管无明显水珠； 7．将沉淀用10ml TE 缓冲液溶解，用紫外分光光度法检测A260nm和A280nm的吸收值，计算DNA浓度、总量及纯度（计算方法自己查询）。 三、操作步骤 1）选取新鲜材料，研磨要迅速彻底（注意液氮不要碰到皮肤），以降低DNA的降解，研磨好的材料应与 CTAB 抽提液充分混匀，CTAB要预热，以抑制DNA酶，并加速蛋白变性，促进DNA溶解； 2）取上清时，不要贪多，以防非核酸类成分造成干扰； 3）若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的酚类物质，添加巯基乙醇（2－5％），并尽可能选取幼嫩的材料； 4）异丙醇要预冷，以减少DNA的降解； 5）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。 四、注意事项